海星不同部位脂质成分分析

周 大 勇， 周 新， 刘 潇 阳， 沈 燕， 于 卓 良

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

海星(Asteriasamurensis)属棘皮动物门海星纲，资源丰富，分布广泛。海星为肉食性动物，专以扇贝、鲍鱼等海珍品为食，严重影响沿海地区的贝类养殖[1]。若能对海星进行有效的开发利用，使其作为营养、无毒的新型海洋食品原料，则可以化害为利。近年来研究发现，海星含有蛋白质(多肽、氨基酸)、多糖、皂苷、甾醇、类胡萝卜素和脑苷脂等多种功能成分[2]，因而具有药用和保健功能。但海星中的脂质作为重要营养成分之一其研究相对较少，缺乏系统性和完善性的研究成果。本实验以海星性腺与体壁为原料，分析了脂质质量分数、脂质组成、脂肪酸组成、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)质量分数、磷脂分子种等脂质信息，有助于开发新型功能保健食品，以期为海星资源的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

海星：辽宁省大连市长兴市场购买。

LG-1.0型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；MK-6S棒状薄层色皮分析仪，雅特隆公司；Agilent 6890N气相色谱仪、Agilent 5973质谱仪，美国Agilent公司；LC-20AD 型高效液相色谱仪，日本岛津公司；ELSD6000蒸发光检测器，美国奥特奇生物技术公司；流动注射泵，美国Harvard Apparatus公司；4000 QTRAP质谱仪，AB Sciex中国公司。

磷脂标准品(PC：12：0/12：0，16：0/18：1; PE：12：0/12：0，16：0/18：1)，Avanti公司；正己烷，上海国药集团；异丙醇，博欧特生物科技有限公司；冰乙酸、三乙胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷、甲酸铵，Sigma中国有限公司；其他试剂购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 原料预处理

将海星体壁和性腺分开后冷冻干燥，经粉碎后置于-80 ℃冰箱存放待用。

1.2.2 脂质提取

利用甲基叔丁基醚(MTBE)法提取海星总脂成分[3]，于-30 ℃储藏待用。

1.2.3 脂质含量计算

海星脂质质量分数按公式(1)计算。

w=m0/m

(1)

式中：m0为海星脂质质量；m为原料质量。

1.2.4 脂肪酸组成分析

利用气相色谱质谱联用仪分析法(GC-MS)检测海星脂质样品的脂肪酸组成[4]。质谱参数：安捷伦气质联用仪(7890A GC-5975C MSD)，HP-5-MS毛细管柱(30 m×0.25 m×0.25 μm)，EI源(70 eV)。根据GC-MS中各组分保留时间以及质谱图，对比脂肪酸标准品，并在NIST02库检索鉴定，通过峰面积归一法各类脂的脂肪酸组成及相对质量分数。

1.2.5 脂质组成分析

利用棒状薄层色谱-氢火焰离子检测器联用分析法(TLC-FID)检测各类脂质样品的组成及质量分数[4]。检测参数：扫描速度30 s/根，空气体积流量2 L/min，氢气体积流量160 mL/min。利用分析软件对所得谱图各脂质成分的峰进行积分，采用峰面积归一化法得到各类脂质成分的相对质量分数。

1.2.6 PC及PE定量分析

利用高效液相色谱串联蒸发光检测器(HPLC-ELSD)检测各类样品脂质中PC、PE绝对质量分数。HPLC检测条件：色谱柱Agilent Zorbax RX-SIL柱，4.6 mm×250 mm，5 μm。流动相A：体积比85∶15∶0.45∶0.05的甲醇、水、冰乙酸、三乙胺混合溶液；流动相B：体积比20∶48∶32 的正己烷、异丙醇、流动相A混合溶液；洗脱方式为梯度洗脱。洗脱条件：0～20 min，90%～70% B；21～35 min，70%～50% B；36～41 min，90% B。体积流量1 mL/min，进样体积10 μL。检测器参数：漂移管温度75 ℃，雾化器体积流量2 L/min，光电倍增管的增益因子为1。PC(16：0/18：1)和PE(16：0/18：1)作为标准品，绘制标准曲线。

1.2.7 磷脂分子种分析

利用直接进样电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)方法定性、定量检测海星甘油磷脂分子种[5-6]。质谱参数：ESI源正离子模式下喷雾电压5 500 V，负离子模式下喷雾电压-4 500 V，雾化气压和涡轮气压分别为172.4和206.8 kPa，离子源温度425 ℃，扫描范围m/z350～1 000。样品检测：通过加内标进行半定量分析定量检测磷脂分子种相对质量分数。定量海星GPCho和GPEtn时，二种部位样品的质量浓度均为100 μg/mL，进样体积流量分别为5和10 μL，加入内标分别为PC 12：0/12：0、PE 12：0/12：0，内标质量浓度为0.35、0.45 μg/mL。

1.2.8 统计学分析

脂质分析实验均做3次平行检测，数据以(平均值±标准差)表示，并使用SPSS 16.0软件进行独立T检验，以P<0.05表示存在显著性差异，以P<0.01表示存在极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 脂质含量

采用MTBE法提取海星油脂，测得海星性腺、体壁脂质质量分数分别为(13.39±0.60)%和(4.34±0.21)%。

海星不同部位脂质含量差异较大。性腺作为海星可食部分，其油脂质量分数相对较高，而海星体壁中油脂质量分数较低。李红艳等[7]研究结果表明海星性腺脂肪质量分数为39.22%，体壁脂肪质量分数为1.54%，推测可能是海星收集地点、季节等不同导致检测结果的差异性。Shah等[8]研究表明季节差异对于海星脂质含量及组成影响较大。

2.2 脂肪酸组成

GC-MS测定海星性腺与体壁脂肪酸组成，结果如表1所示。由表1可以看出，海星脂质中脂肪酸主要包括C16：0、C18：0、C20：1n-9、C20：5n-3(EPA)和C22：6n-3(DHA)。海星性腺和体壁PUFA质量分数分别为57.35%和49.53%，其中EPA和DHA质量分数分别为26.36%～30.10%和7.79%～10.35%。李红艳等[7]研究海星脂质发现，海星性腺和体壁中PUFA质量分数分别为48.92%和50.00%，以EPA、DHA为主。虽然海星体壁脂肪酸含量较低，但是其种类丰富，且含有丰富的PUFA，可用于功能保健食品的开发。

2.3 脂质组成

利用TLC-FID测定海星不同部位脂质组成，结果如表2所示。海星脂质成分含有极性脂(PoL)、甘油三酯(TAG)、二酰甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、胆固醇(CHO)等5种，其中PoL质量分数最高，可达总脂的73.70%～86.69%。海星中TAG质量分数较低，为总脂的7.07%～18.62%。杜磊等[9]通过体内、体外实验研究海星脂质功能作用发现，海星中磷脂极性脂质体具有较强的抗肿瘤活性。可见海星可作为磷脂产品开发的新型原料，海星资源得到有效的利用。

表1 海星不同部位的脂肪酸组成

表2 海星不同部位的脂质组成

2.4 主要磷脂含量

海星磷脂中主要含有PC和PE[10-11]，利用HPLC-ELSD进行检测，结果如表3所示。从表3可以看出，海星性腺中PC和PE含量丰富，性腺较体壁中的含量更高。Kostetsky等[12]研究表明，海星磷脂质量分数为总脂的(32.1±0.5)%，PC、PE分别为磷脂的50.4%、25.6%，是海星器官中主要的磷脂成分。PC、PE是重要的功能性磷脂成分，是维持人体新陈代谢必须物质之一，具有重要的生理功能[13]。海星中PC、PE质量分数丰富，可作为新型保健功能食品的原料。

表3 海星不同部位磷脂中PC和PE质量分数

2.5 不同部位磷脂的分子种轮廓

2.5.1 不同部位磷脂分子种定性分析

甘油磷脂GPCho、GPEtn通过直接进样法检测，质谱特征性扫描得相应磷脂一级质谱图，如图1所示。

根据一级质谱图质量数信息初步鉴定分子种，但是甘油磷脂sn-1、sn-2位脂肪酸的结构信息不能具体给出，需进行二级质谱扫描。根据裂解碎片信息，以进一步推导磷脂的准确结构。海星甘油磷脂GPCho、GPEtn分子种结构推导根据Yin等[5]的描述。

(a) GPCho

(b) GPEtn

2.5.2 不同部位磷脂分子种定量分析

采用内标法定量检测海星磷脂分子种，根据一级谱信号强度计算GPCho、GPEtn分子种相对质量分数，结果见表4～5。由表4、表5可知，海星GPCho、GPEtn分子种结构分别有38种和34种。GPCho中主要含有phosphatidyl 18：1/20：5、18：1/22：5和20：1/20：5，plasmenyl 18：3/20：1和20：3/18：1，plasmanyl 18：4/20：1和20：4/18：1。GPEtn中主要含有phosphatidyl 18：0/20：5、18：1/20：1和20：3/20：5，plasmenyl 20：3/20：5和plasmanyl 20：4/20：5。由此可见，海星中主要分子种脂肪酸为C20：5，在海星性腺中质量分数相对更高。Kostetsky等[14]推测海星PC分子种25种，其主要结构为16：0/20：5和18：0/20：5；推测海星PE分子种27种，其主要结构为18：0/20：5和18：0/20：4。相对于甘油酯型PUFA，磷脂型PUFA具有更好的生物利用度、组织传送能力和促进健康的作用[15]。因此，海星可作为提取磷脂型PUFA的新型原料，促进海星资源的开发利用[16-17]。

表4 海星不同部位GPCho分子种定量分析结果

续表

表5 海星不同部位GPEtn分子种定量分析结果

810Phosphatidyl 20:5/22:60.10±0.010.12±0.02812Phosphatidyl 20:5/22:5Phosphatidyl 20:4/22:60.63±0.02**0.31±0.05

3 结 论

海星性腺油脂含量较高，为(13.39±0.06)%，体壁油脂质量分数仅为(4.34±0.21)%。海星油脂中PUFA质量分数较高，为总脂的49.53%～57.35%，以EPA、DHA为主。另外，海星性腺与体壁含有TAG、DAG、PoL、FFA和CHO等成分，其中PoL最为丰富，占总脂的73.70%～86.60%。海星磷脂以PC、PE为主，分别定性、定量分析得到70种分子种结构，主要包含的脂肪酸为C20：5。

海星脂质信息丰富，含有较多的PoL、PUFA以及磷脂型EPA等功能性脂质成分，具有重要的营养功能价值，可开发新型功能保健食品。