荧光显微镜自组实验设计

刘东奇

(南开大学 物理科学学院，天津 300071)

荧光显微镜在诸多领域都有着重要的应用. 在物理方面，荧光显微镜在量子点和色心缺陷等零维材料、碳纳米管和金属纳米线等一维材料、二硫化钼和其他过渡金属硫化物等二维材料、各类荧光晶体等三维材料的荧光特性研究中是必不可少的研究工具[1-4]；在生物、医药方面，观察蛋白质、DNA、生物细胞、组织等的结构和探求作用机理，以及药物颗粒传输、药物作用效果时常用到的各类荧光标记物都可以在荧光显微镜或性能优异的超分辨荧光显微镜上观测[5-7]. 目前，荧光显微镜的应用领域变得越来越广泛，也是许多热点研究问题的有力表征手段，而相应的光学基础实验教学内容还处于空白状态.

把荧光显微镜的基本原理、光路构造、技术特点、实际应用等方面综合起来作为理工科学生、尤其是物理学科本科学生光学实验的一部分将是有益的尝试. 本文设计了基于光学平台的荧光显微镜自组实验，学生通过自行设计、光路搭建调节，组装完成荧光显微镜设备，让学生掌握荧光成像原理，优化成像条件，完成荧光图像和荧光光谱的采集.

1 荧光显微镜的设计和光路搭建

荧光显微镜的主要光学元件从大恒光电公司和索雷博公司购置，安装在支杆和底座组成的支架上，便于在光学面包板上调节光学元件的高度和位置.

荧光显微镜光路的搭建步骤为：

1)将激光器和白光光源置于光学面包板上的合适位置，通过调节各自支架的俯仰旋钮，使激光光束和白光光束轴向平行且高度一致；

2)将一反射镜镜面调节到与白光光路成45°放置，将另一反射镜放置于一维平移台上，其镜面与激光光路成45°，推开平移台时白光光束照射样品，推入平移台时激光光束照射样品；

3)双色镜与入射光路成45°放置，入射光依次经过双色镜、透镜、物镜后照射到装载于三维手动平移台的样品上，样品受激发出的荧光经双色镜透射进入后方荧光采集光路；

4)将一反射镜装载于一维平移台上，其镜面与荧光光路成45°，推开平移台时荧光进入后方的光谱仪完成光谱测量，推入平移台时荧光进入后方的CCD完成荧光图像采集.

搭建的荧光显微镜主要光路如图1所示. 所用反射镜为镀银反射镜，可见光区域的反射率大于95%；透镜为凸透镜，焦距为50 mm；所用荧光样品为CdTe/CdS量子点，通过移液枪吸取50 μL浓度为0.2 mg/mL的量子点悬浊液，滴涂在170 μm厚度的石英载玻片上制备而成. 荧光显微镜采用反射式光路，激光和白光光束均通过物镜照射到样品上，样品受激发射的荧光通过同一物镜被后方荧光光路收集. 激光激发光路和白光照明光路可以通过装载于一维手动平移台的反射镜进行光路的自由切换. 荧光收集光路可以通过装载于一维手动平移台的反射镜实现光谱探测光路和CCD成像光路的自由切换.

图1 荧光显微镜光路图

2 荧光显微镜性能测试

2.1 荧光显微镜光学分辨率测量

利用标准光学分辨率板在白光照明条件下测荧光显微镜的空间分辨能力. 将图1中接入激光光束的反射镜(装载于一维手动平移台上)移开，白光光束可照射到样品上. 同时，将荧光光路中的反射镜(装载于一维手动平移台上)移入，CCD相机可采集图像. 图2是选用放大倍数40倍、数值孔径为0.6的物镜拍摄的标准光学分辨率板的图像. 组装完成的荧光显微镜可分辨700 lp/mm的线对，相应的光学分辨率为714 nm. 对于配备数值孔径为0.6物镜的该荧光显微镜，白光照明下其光学分辨率接近此处的光学衍射极限.

图2 白光照明下荧光显微镜拍摄的 标准光学分辨率板的图像

2.2 荧光光谱测量和荧光图像采集

荧光显微镜所配的光谱仪型号为海洋光学QE65000型光纤光谱仪，测量光源光谱时可以将光纤直接对准光源光束进行光谱采集，测量荧光光谱时可以直接接入荧光光路进行光谱数据采集. 学生在使用光纤光谱仪时，需要将光源强度调低，避免光强度超过光谱仪量程，长时间采集时损坏仪器. 可以将接入光谱仪的一端光纤拔下对准纸面通过肉眼观察耦合进入光纤的光源强度，将光源调节到合适强度后再将光纤一端接入光谱仪进行光谱数据采集. 图3(a)是白光光源的光谱，光谱范围400～1 050 nm. 图3(b)是激光光谱和样品的荧光光谱，激光波长为561 nm，所用样品为CdTe/CdS量子点，荧光范围650～800 nm，荧光峰位于720 nm处.

(a)白光光源的光谱

(b)激光光谱和样品的荧光光谱图3 白光光源光谱和激光光源及相应荧光光谱

将图1中接入激光光束的反射镜(装载于一维手动平移台上)移入，白光光束被阻挡，激光光束可以照射到样品上. 同时，将荧光光路中的反射镜(装载于一维手动平移台上)移入，CCD相机可以采集相应荧光图像. 图4(a)是激光照射下拍摄的带有十字型标记的样品的荧光图像，图中颜色为伪色，粉紫色区域荧光强度最强，蓝色区域荧光强度次之，绿色区域荧光强度较弱，红色区域荧光强度最弱. 作为对比，图4(b)是白光照明下拍摄的相同区域的样品图像. 从图4中可以看到，白光照明图像中的十字型标记清晰可见，图中白色区域为无量子点或量子点稀少的区域，灰色区域是量子点团聚的区域. 荧光图像和白光照明图像中的十字型标记形状一致，荧光图像中的十字型标记主要呈现红色，表明十字型标记位置为无量子点或量子点稀少的区域；而荧光图像两侧的红色区域为激光光斑未照射到的区域或激光光斑强度极弱的区域，该区域不发出荧光或发出极弱的荧光，主要呈现红色；荧光图像中呈现粉紫色的区域是量子点团聚程度最高的区域，荧光强度最高. 在白光照明图像中各个量子点团聚区域的内部的衬度较为一致，内部细节区别不明显，而荧光图像可以更为清晰地判断白光照明图像中衬度基本一致的区域内哪些位置处的量子点分布更多，荧光强度更强，尤其是量子点团聚的点状区域在荧光图像中表现更为直观.

(a)激光照射下拍摄的带有十字型标记的样品荧光图像

(b)白光照明下拍摄的相同区域的样品图像 图4 样品的荧光图像及相同区域白光成像

2.3 改进和拓展

自行设计、组装的荧光显微镜可以实现稳定工作，其光路切换简单快捷. 除目前所用光谱仪价格较贵外，其他光学元件的经济成本都在可接受范围. 对于光谱仪，可选用国产厂家的光纤光谱仪或普通光谱仪，价格便宜.

荧光显微镜自组实验的设计初衷是建立1套开放式系统，可以根据实验教学需要在后期的实际使用过程中自行加入其他光学模块实现相应功能，比如加入多路激光光路、偏振光路等.

3 结束语

基于光学平台的光学自组实验，学生将通过自行设计荧光显微镜光路，组装集白光照明成像、激光激发荧光成像、荧光光谱探测等功能于一体的开放式系统. 整个系统原理简单、结构紧凑，与前沿科学研究联系更为紧密，适合于作为理工科尤其是物理学科本科生的光学实验内容. 该实验可以让学生完成基本光路调节的技能培养和荧光显微镜基本原理等知识的获取，学生还可以进一步根据需要扩展此系统的功能，完成探究型物理实验的内容.