高效液相色谱法测定肠宁胃舒片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量*

崔明筠，付开聪，张雪梅，罗 健（普洱市民族传统医药研究所，云南676200）

肠宁胃舒片是云南省普洱市民族医院的临床使用方剂，为了更好地服务患者，该院经与北京师范大学药物研究工程中心联合研究开发，研制出具有健脾和胃之功效的院内制剂，该制剂用于治疗脾胃气虚、倦怠乏力、嗳气、胸闷、脘腹胀痛或疼痛、大便不实等。处方由黄芪、党参、白术、茯苓、木香、砂仁、茵陈、白及、海螵蛸等组成，属纯中药制剂。黄芪具有补气升阳、生津养血等功效，在方中为君药，固选择黄芪作为肠宁胃舒片质量控制的研究对象。本研究建立的高效液相色谱法，为肠宁胃舒片的质量控制提供了有效的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 仪器为高效液相色谱仪（Waters 1525）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司KQ250）、电子分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司AG135）等。试药为毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111920～201304）、肠宁胃舒片（云南省普洱市民族医院制备，批号：20171101、20171102、20171103）等。甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为纯净水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件[1-4]色谱柱为Waters XTerra@RP18 C18柱（3.9 mm×150.0 mm，5µm），流动相为甲醇-0.20%甲酸水溶液（27∶73）梯度洗脱，设定检测波长为260 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为10µL。肠宁胃舒片梯度洗脱条件见表1。

表1 肠宁胃舒片梯度洗脱条件

1.2.2 样品的制备[5-8]

1.2.2.1 对照品溶液 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加入溶剂甲醇，超声处理，定重法制成每毫升含0.739 2µg对照品的溶液，即可。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取肠宁胃舒片适量，研磨成细粉，取肠宁胃舒片细粉4 g，精密称定样品重量，置于具塞三角瓶中，加入甲醇50 mL，超声提取30 min，精密称定超声处理前后样品重量，用甲醇补足溶剂损失的部分重量，摇匀，过滤装置除渣，取滤液，制得肠宁胃舒片供试品溶液。

1.2.2.3 阴性对照溶液 按处方配比除去黄芪，依照肠宁胃舒片制备工艺制得阴性样品，再依据肠宁胃舒片供试品溶液制备方法配制，备用。

1.2.3 系统适用性试验 吸取缺黄芪阴性对照溶液、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液和肠宁胃舒片供试品溶液各10µL，在“1.2.1”项下的色谱条件下，分别记录样品出指标峰的保留时间。

1.2.4 线性关系考察 设定高效液相色谱仪的运行程序，分别自动精密吸取对照品溶液 3、5、8、10、13、15 µL，记录不同进样量对照品峰面积，以不同进样体积为横坐标，待测指标峰（毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰）面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，进样10µL，连续测定6次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积。

1.2.6 稳定性试验 精密吸取同一批号肠宁胃舒片（20171101）供试品溶液，在“1.2.1”项下的色谱条件下，分别于 0、2、4、6、8、12 h 测定其含量。

1.2.7 重复性试验 精密称取6份同一批号肠宁胃舒片（20171101），按肠宁胃舒片供试品溶液制备方法制得供试品溶液，依次记录肠宁胃舒片出指标峰的峰面积大小。

1.2.8 加样回收率试验 精密称取6份同一批号肠宁胃舒片（20171101）样品2 g，置50 mL容量瓶中，于容量瓶中加入已知浓度的对照品溶液2.8 mL，按“1.2.2.2”项下的方法制备加样回收供试品溶液，进样10µL，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积，计算加样回收率。

1.2.9 样品测定 取3个不同批号的肠宁胃舒片（20171101、20171102、20171103），每个批次样品取 3 份，按“1.2.2.2”项下的方法制得待测样品溶液。分别记录3个批次肠宁胃舒片的指标峰面积，计算3批样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。

2 结 果

2.1 色谱条件和系统适用性 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液的保留时间为22.649 min，肠宁胃舒片指标峰的保留时间为22.575 min，二者保留时间基本一致，而阴性对照品溶液在此保留时间内未出现相应的峰，表明采用该色谱条件，在肠宁胃舒片指标峰测定过程中，没有其余成分对其产生干扰，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 线性关系的确定 回归方程为Y=78368X-3485。毛蕊异黄酮葡萄糖苷线性范围为0.022～0.111µg（R2=0.997）。

2.3 精密度试验 毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.40%，精密度良好。

2.4 稳定性试验 供试品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为0.31%，表明肠宁胃舒片供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验 肠宁胃舒片样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的RSD为0.39%，重复性好。

2.6 加样回收率试验 该方法加样回收率符合要求，见表2。

2.7 样品测定 3个批次的肠宁胃舒片样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量见表3。肠宁胃舒片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均值为每片0.051 mg。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

表3 肠宁胃舒片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定结果（毫克/片）

3 讨 论

本研究采用紫外可见分光光度计180～400 nm扫描，得出毛蕊异黄酮葡萄糖苷的最大吸收波长在260 nm处，因此，选择260 nm为检测波长。处方含黄芪、党参、白术和茯苓等中药，试验开展过程中，作者首先参照文献[9-12]及2015年版《中华人民共和国药典》黄芪项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定方法，分别采用Waters C18、Agilent HC-C18和 Diamonsil C18色谱柱未得到分离度良好的指标峰，表明运用此方法，处方中药材含有的其余物质对毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰产生了干扰，经多次试验探索，结果显示，采用Waters C18色谱柱，按照“1.2.1”项下的色谱条件试验得到的指标峰，分离度好，方法稳定，经耐用性实验考察，结果良好。

在样品制备条件探索过程中，本研究对超声提取法的提取时间进行了考察，设置样品超声提取时间为15、30、45、60 min，结果显示，超声提取 30 min 与超声提取45、60 min测得样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量不存在显著性差异，固超声提取时间设置为30 min。

肠宁胃舒片的主要作用是健脾和胃，理气止痛，用于脾胃虚弱、胃气郁滞、胃失和而致胃脘隐痛、绵绵不休、纳呆便溏等。方中以黄芪补气健脾为君药；臣药为党参、白术、茯苓，具有益气、健脾、湿加、强补气助运之功。肠宁胃舒片中黄芪为君药，定量测定黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，采用先进的分析技术方法，可为肠宁胃舒片的质量控制提供科学依据，以便更好地为患者服务，实现医院中药制剂的现代化研究，推进中药制剂安全、有效、可控的良性发展[13-14]。本研究所得色谱图的分离度好，方法简单易行，重现性好，保留时间较合适，具有良好的适用性，适用于肠宁胃舒片的质量控制。