可注射胶原水凝胶复合间充质干细胞在骨组织工程中的应用研究

吕兰欣，杨红宁，颜晓庆，胡书群，燕宪亮，许 铁

骨在一定程度上有再生和修复的能力，但是很多情况下仅仅依靠骨自身的再生能力修复无法完成，如车祸等外部因素造成的骨不连、感染或骨肿瘤切除后的骨缺损，整形外科手术(颌面、颅面以及口腔)等[1-2]。组织工程的提出为骨缺损修复这一难题的解决提供了希望，水凝胶支架被广泛研究用于骨和软骨组织工程领域[3-6]。胶原水凝胶制备简便安全，不需要使用任何交联剂，在37 ℃环境下自动交联，且可以通过改变胶原浓度调整其力学性质，同时胶原也是骨骼的主要组成成分之一，因此是一种有潜在应用价值的骨组织工程支架[7-9]。干细胞作为组织工程的种子细胞之一也被应用于骨组织工程领域。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, hMSCs)具有易获取、易向成骨分化的特点，常作为骨组织工程的种子细胞[10-12]。作者的前期研究表明脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)可促进MSCs成骨分化。作者制备了鼠尾胶原水凝胶与人骨髓间充质干细胞/人脐静脉内皮细胞(hMSCs/HUVECs)复合物，并对水凝胶的细胞相容性进行了研究，对共培养系统成骨分化能力进行了检测，为水凝胶封装细胞复合物用于骨缺损修复提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料鼠尾胶原(4.89 mg·mL-1)购自Corning公司；hMSCs由英国基尔大学ISTM研究所提供；HUVECs细胞购自ALLCELLS公司；细胞培养相关试剂耗材均购自Hyclone公司；成骨诱导液配置所需试剂以及ARS染料均购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购自VICMED公司；BCIP/NBT试剂购自美国AMRESCO公司；Live&Dead试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2仪器光学显微镜和荧光显微镜均购自德国Leica公司；全波长酶标仪购自美国Bio-tek公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司；超净工作台购自中国苏州安泰公司。

1.3胶原水凝胶—细胞复合物制备将hMSCs和HUVECs从液氮中取出复苏，在37 ℃5% CO2培养箱中培养至80%～90%融合，胰酶消化计数后按hMSCs∶HUVECs=10∶0、hMSCs∶HUVECs=5∶5及hMSCs∶HUVECs=9∶1的比例将两种细胞混合备用。按表1所示配置1.96 mg·mL-1浓度的胶原溶液(前期实验显示此浓度下形成的胶原水凝胶硬度适中且适宜细胞生长)和细胞复合物，取200 μL混合溶液加入1 cm2的样品框内，每个样品所含细胞总量均为4×104，置于37 ℃细胞培养箱中1 h，凝胶形成后取出转移至24孔板培养。细胞接种7 d后在显微镜下观察水凝胶中细胞的形态。

表1 配置胶原溶液和细胞复合物所需试剂

1.4细胞相容性检测水凝胶—细胞复合物培养7 d后，每组取出两个样品进行Live & Dead染色，观察细胞的存活和死亡情况。首先用PBS洗涤样品3次，每次5 min，尽量去除培养液中的血清；将20 μL染料B加入10 mL PBS充分混匀，再加入5 μL染料A混匀；将混合好的染液加入样品中避光孵育1 h后用PBS洗涤3次；用荧光显微镜观察染色情况，485 nm激发光观察活细胞情况，530 nm激发光观察死细胞情况。

1.5细胞增殖检测将水凝胶—细胞复合物制备后的3、5、7 d，用CCK-8来检测细胞的增殖情况。CCK-8溶液以1∶10稀释于培养基中混匀，每个样品加入500 μL稀释液后于5%CO2培养箱中37 ℃孵育2 h，然后每孔取100 μL液体转移到96孔板中，在酶标仪上读取450 nm波长处吸光值。样品换入新鲜培养液继续培养。实验重复3次，每样品设置6个重复。

1.6成骨分化检测为了检测HUVECs，在第7天CCK-8检测结束后，PBS洗涤样品3次，加入成骨诱导液(包括DMEM低糖培养基、10% 胎牛血清、1% 双抗、10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠、10 nmol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1抗坏血酸、300 mg·L-1谷氨酰胺、10 nmol·L-11, 25-羟基维生素D3)继续培养。诱导7 d后，对成骨分化早期标志物碱性磷酸酶(alkaline phoshatase, ALP)进行检测。每组取4个样品用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，加入BCIP/NBT染液，避光放置30 min后用超纯水洗1次，用倒置显微镜明场进行观察。然后用丙酮浸泡1 h后取100 μL液体转移至96孔板，用酶标仪于570 nm处测量反应后溶液的吸光值。诱导21 d后，用茜素红S(alizarin red S,ARS)对成骨分化晚期标志物钙结节进行检测。每组取4个样品，PBS漂洗后用70%乙醇固定1 h，用40 mM茜素红S-PBS溶液染色20 min。染色后，样品用自来水冲洗5遍，用倒置显微镜明场观察。然后，用10%十六烷基氯化吡啶溶液溶解被茜素红S染色的钙结节，于37 ℃反应30 min，取100 μL液体转移至96孔板，用酶标仪于490 nm处测量反应后溶液的吸光值。

2 结果

2.1细胞相容性为检测鼠尾胶原水凝胶以其制备过程对细胞的活性影响，对3组不同细胞比例的样品进行了Live & Dead染色，如图1所示，可见大部分细胞染色为绿色(图1A-C)，为活细胞；极少量死亡细胞呈现球形，被染为红色(图1A’-C’)。这说明胶原本身以及水凝胶制备过程未对细胞活力产生影响。接种7 d后细胞形态如图2A-C所示，可见细胞在水凝胶内部呈现长梭形，细胞之间形成网格状连接。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0组；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5组；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1组；绿色：活细胞；红色：死细胞。图1 3组胶原水凝胶—细胞复合物培养第7天Live&Dead染色结果

2.2细胞增殖检测为了检测胶原水凝胶对细胞增殖能力的影响，对3组不同细胞比例的样品进行了CCK-8检测，结果如图2D所示，3组细胞在第3天测得的OD值较低， hMSCs∶HUVECs=5∶5组最低(0.167±0.002)，hMSCs∶HUVECs=10∶0组最高(0.201±0.010)，hMSCs∶HUVECs=9∶1组居中(0.186±0.002)；第5天检测结果显示，各组OD值均略有增高；第7天检测结果显示，各组细胞的OD值均有显著增加，hMSCs∶HUVECs=10∶0组与hMSCs∶HUVECs=9∶1组之间差异无统计学意义(P>0.05)OD值分别为(0.964±0.025)和(0.951±0.040)，两组细胞OD值与hMSCs∶HUVECs=5∶5组(0.805±0.029)相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0组；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5组；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1组；D：CCK-8结果。①与B组相比较，P<0.05。图2 3组水凝胶—细胞复合物培养第7天明场显微镜观察以及CCK-8检测细胞增殖结果

2.3成骨分化检测图3所示为ALP染色结果，可见3组细胞均有明显的成骨分化(图3A-C)；图3D为吸光值检测结果，可见hMSCs∶HUVECs=5∶5组相较于其他两组ALP产生量明显偏少(P<0.05)；图3E为根据hMSCs细胞量修正后的各组ALP检测结果，修正后的结果显示hMSCs∶HUVECs=5∶5组hMSCs产生ALP的量(0.319±0.008)显著高于另外两组，而hMSCs∶HUVECs=9∶1组(0.196±0.002)高于hMSCs∶HUVECs=10∶0组(0.170±0.004)。图4为ARS染色结果，可见3组细胞均有明显的红色染色区域(图4A-C)，说明3组细胞均有钙结节的产生；图3D为钙结节染色溶解后吸光值检测结果，同样可见hMSCs∶HUVECs=5∶5组相较于其他两组钙结节产生量明显偏少(P<0.05)；根据hMSCs细胞量进行修正后，各组钙结节产生量的结果如图4E所示，各组间的吸光值趋势与ALP染色结果一致，hMSCs∶HUVECs=5∶5组hMSCs产生的量(1.482±0.012)显著高于另外两组，而hMSCs∶HUVECs=9∶1组(0.879±0.018)高于hMSCs∶HUVECs=10∶0组(0.786±0.018)。

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0组；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5组；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1组；D：吸光值结果；E：根据细胞数修正后结果。①与B组相比较，P<0.05。图3 3组水凝胶—细胞复合物诱导培养第7天ALP染色结果

A：hMSCs∶HUVECs=10∶0组；B：hMSCs∶HUVECs=5∶5组；C：hMSCs∶HUVECs=9∶1组；D：吸光值结果；E：根据细胞数修正后结果。①与B组相比较，P<0.05。图4 3组水凝胶—细胞复合物诱导培养第21天ARS染色结果

3 讨论

自体骨移植一直被视为骨缺损治疗的金标准，但其来源有限，异体骨和异种骨移植也存在排异反应等问题[13-15]。Ⅰ型胶原纤维含有精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列在内的结合位点，有利于细胞的黏附和增殖，而且具有良好的生物降解性，易被生物体吸收，被广泛应用于组织工程骨的组成成分之一[16-17]。骨组织工程支架既要为细胞的黏附和增殖提供空间，还要有一定的孔隙率和连通性以满足骨和血管再生所需要的空间，还要为营养物质、代谢产物提供运输的通道[18-20]，而水凝胶支架则可以满足以上要求。因此，本研究采用Ⅰ型胶原制备水凝胶—细胞复合物，接种7 d可见细胞伸展良好，细胞间形成连接，且在整个水凝胶支架内部均匀分布(图2A-C)，水凝胶内整体细胞存活率高(图1)，在渡过接种初期的适应期后细胞增殖速度明显升高(图2D)，这些结果也表明采用的水凝胶及制备方法均有很好的细胞相容性。Nguyen等也发现，在第3天进行Live & Dead染色，接种于培养板的细胞平铺于表面，而封装于胶原水凝胶内部的细胞则明显变窄伸长，更接近组织内部细胞形态[9]。另外，有研究组用海藻酸钠—壳聚糖水凝胶封装MSCs，在第2天进行Live/Dead染色发现细胞有一些死亡，存活细胞呈现圆形，但CCK-8结果显示细胞在第3天和第7天增殖明显[21]。在胶原水凝胶中，细胞能够更好地与胶原纤维上的RGD短肽结合，在接种早期即可黏附于胶原纤维上，所以会在第3天即呈现长梭形而非球形，这也说明了胶原水凝胶具有更好的生物相容性。本研究中在第7天时，50% HUVECs含量组测得的OD值明显小于另外两组，这可能是由于HUVECs的增殖能力与hMSCs有一定差距。Bidarra等的研究显示，HUVECs与MSCs的共培养过程中，HUVECs所占百分含量会随时间逐渐降低，这也意味着MSCs的增殖能力优于HUVECs[22]。

ALP和钙结节是MSCs成骨分化早期和晚期的标志物，在诱导分化的3～14 d，ALP含量会显著增加，而钙结节是成骨细胞分泌骨基质并矿化形成的，是成骨晚期的主要标志物[10,23]。本研究选用BCIP/NBT染料在第7天对ALP进行染色，选用ARS在第21天对钙结节进行染色，可见ALP和钙结节的产生。图3D和图4D的OD值检测结果均显示50%含量HUVECs的组ALP和钙结节产生量明显低于另外两组，这一结果与其他研究者的结论不符。Gershovich和Saleh等均发现，HUVECs与hMSCs共培养时，ALP表达量显著升高，这说明HUVECs可以促进hMSCs的成骨分化[24-25]。本研究根据hMSCs细胞量对吸光值结果进行了修正，修正后结果显示10%含量的HUVECs对hMSCs成骨分化略有促进，而50%HUVECs对hMSCs成骨分化作用显著，修正后结果与其他研究组结果相符。

本研究安全便捷地制备了一种复合hMSCs/HUVECs的胶原水凝胶，生物相容性好，可以促进干细胞的成骨分化，此胶原水凝胶—细胞复合物可注射且通过温度交联，是一种非常有前景的骨缺损修复材料。