改良的粪便脱落细胞富集方法的富集效率分析

张静宜， 杨 静， 邹 明， 何玉琦， 盛剑秋

陆军总医院消化内科，北京 100010

结直肠癌在我国所有恶性肿瘤发病率中排名第3位[1]。然而，到医院就诊的结直肠癌患者多已到中、晚期，手术后5年内生存率仅为30%～50%。结肠镜检查是目前筛查结直肠肿瘤的金标准，但作为侵入性检查，患者的接受率及依从性较低。文献报道，即使是美国这样的发达国家，也只有约60%的高危人群能够进行结直肠癌结肠镜筛查[2]，而在我国参与结直肠癌结肠镜筛查的不足20%[3]。采用粪便或血液标志物筛查简便易行，花费相对较低，但目前常用的血清肿瘤标志物(如CEA、CA199和CA242等)检测的敏感性和特异性较低，无法应用于早期癌的筛查。粪便DNA检测因其敏感性高、无创性的特点受到越来越多关注，已被美国预防服务工作组(USPSTF, U.S. Preventive Services Task Force)推荐为筛查项目[4]。但粪便结直肠癌DNA筛查所需检查项目多，操作繁琐，花费昂贵，以及由于人种间遗传差异，美国人群中采用的粪便DNA标志物组合不适合我国国情。

健康人每天有数百万细胞从肠壁脱落并通过大肠蠕动排出体外。在癌前病变和癌症发展的各个阶段，细胞也会脱落进入排泄系统，其中一些细胞含有与癌症相关的基因突变[5]。提取粪便中的脱落细胞进行多靶点基因突变检测，可以提早发现结直肠肿瘤。陆军总医院消化内科课题组从上世纪90年代中期开始研究粪便脱落细胞检测技术诊断结直肠癌，开发出了粪便脱落细胞的保存液和粪便脱落细胞提取流程，明显提高了结直肠癌的检出率[6-7]。本次实验我们通过改良的筛网淘洗法结合特殊纳米磁珠富集脱落细胞，明显提高了细胞富集率，并对富集到的细胞提取DNA和RNA检测管家基因表达(β-actin和RNU6)，为后续进行突变基因分子生物学验证提供基础。

1 材料与方法

1.1材料2015年10月至2016年6月陆军总医院消化内镜中心进行结肠镜检查患者通过调查问卷确定高危人群[8]。收集患者年龄、性别、肿瘤部位、Duke’s分期等信息。排除标准：(1)伴有结直肠外的恶性肿瘤患者；(2)曾进行手术、放化疗等治疗；(3)结直肠癌患者同时患炎症性肠病或其他自身免疫性疾病；(4)非原发癌灶者及不能确诊的患者。本次研究获得陆军总医院伦理委员会批准和患者的知情同意。

1.2试剂与器材肠道细胞液基保存液(本院自制)；苏木精染液(Fluka公司)；伊红染液(北京博尔西科技有限公司)；RNAprotect Cell Reagent(QIAGEN)；hNOK-hSeF单克隆抗体(清华大学医学院)；纳米磁珠(解放军陆军总医院消化内镜实验室配制)；单克隆抗体-叶酸纳米磁珠(北京化工大学配制)；DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；HOTStartTaq酶(大连宝生物工程公司)；d NTPs(2.5 mmol/L)(大连宝生物工程公司)；10×PCRBuffer(大连宝生物工程公司)；β-actin引物(上海生工生物技术公司)；引物试剂盒(德国QIAGEN公司)；琼脂糖(瑞士Roche 公司)；PBS 干粉(北京索莱宝科技有限公司)；筛网30、100、200目(江苏海门仪器厂)；台式离心机(北京医用离心机厂)；换气消毒工作台(北京航天科恩公司)；紫外灯(Upland 公司)；紫外分光光度仪752 型(上海光学仪器一厂)；实时定量PCR仪7500(美国Applied Biosystems 公司)；恒温水浴箱(美国Polyscience公司)；恒温震荡器(HZ-9211K)(华利实验设备公司)；CF-H260AI、CF-H290AI内镜(日本奥林巴斯公司)；低温冰箱(-80 ℃、-20 ℃)(德国西门子公司)。

1.3改良的粪便脱落细胞富集步骤患者于结肠镜检查当日清晨口服清肠药，采用我中心研发专利《排泄物提取脱落的肠壁上皮细胞的装置》[9](见图1)，该装置包括固定装置(收集器主体)、收集装置和收集瓶(可拆卸)，臀部与装置接触面设计为肾形，避免混杂尿液，排除泌尿系肿瘤的影响，收集器主体与收集瓶接合处安置滤网，初步过滤粪便中的杂质，过滤后的粪水进入收集瓶中，送至实验室富集细胞。收集患者第4次清肠液，过滤后的粪水进入收集瓶中，送至实验室富集细胞。含脱落细胞的粪水加入肠道细胞液基保存液后室温下静置约2 h，弃上清，留约100 ml，如果标本不够100 ml，则加入细胞液基保存液至100 ml。标本经改良的筛网淘洗法(改进淘洗步骤和调整使用不同目数的滤网)淘洗后；滤液倒入50 ml离心管中，室温下1 500 r/min离心10 min，离心半径90 mm；弃上清，留约2 ml沉渣，加入免疫磁珠60 μl(hNOK/hSef 单克隆抗体-叶酸纳米磁珠[10-11]，添加液基保存液至5 ml，吹打混匀，37 ℃恒温箱中孵育；将细胞悬液倒入15 ml离心管；弃上清，液基保存液冲洗管壁，制成细胞悬液吹打均匀。富集到的粪便脱落细胞加入RNAlater中-80 ℃保存。

图1 排泄物提取脱落的肠壁上皮细胞的装置 Fig 1 Device for removing exfoliated epithelial cells from stool

1.4粪便脱落细胞中总DNA和RNA提取及内参基因检测对粪便脱落细胞参照试剂盒操作说明书提取总DNA和RNA，分光光度计测定DNA浓度，NanoDrop测定RNA浓度，电泳检测DNA和RNA完整性，qRT-PCR检测细胞内参基因(β-actin和RNU6)信号，质控体系流程(见图2)。

图2 脱落细胞质量控制体系流程图Fig 2 Flow chart of quality control system of exfoliated cells

1.5统计学分析采用SPSS 19.0统计软件，对年龄进行t检验，对性别、临床类型等计数资料采用卡方检验和Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般资料本实验共选取了52例结直肠癌和34例进展期腺瘤患者粪便脱落细胞标本，其中52例结直肠癌患者(TNM Ⅰ期和TNM Ⅱ期)，男40例，女

12例，年龄46～82岁，Ⅰ期癌患者19例，Ⅱ期癌患者33例；34例进展期腺瘤患者(腺瘤直径>1.0 cm)，男20例，女14例，年龄45～77岁。另有16例结肠镜检查结果正常的作为阴性对照组，男8例，女8例，年龄30～70岁。临床病例资料如表1所示。

表1 患者临床资料Tab 1 Clinical pathological characteristics of patients

2.2特殊抗体-叶酸纳米磁珠的制备根据hNOK和hSef的特点设计出抗原后免疫Balab/C小鼠，选取免疫反应最佳的小鼠，经过SP2/0融合、有限稀释法筛选、制备腹水等过程，获得hNOK和hSef的单克隆抗体[9-10]，与葡聚糖包覆四氧化三铁磁性纳米颗粒复合材料偶联，离心去除多余抗体，制成包被叶酸和肿瘤单抗的特殊纳米磁珠。

2.3qRT-PCR检测细胞内参基因(β-actin)信号结果102例样本的粪便脱落细胞悬液提取总DNA后，样本内参基因(β-actin)信号均为阳性，富集效率为100%，PCR扩增曲线如图3所示。

2.4qRT-PCR检测细胞内参基因(RNU6)信号结果

102例样本的粪便脱落细胞悬液提取总RNA后，OD值均在1.8～2.0，表明样本未受到蛋白质、DNA或异硫氰酸胍的污染；电泳结果能清晰地显示，5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA三条带，说明RNA完整性较好(见图4)。内参基因(RNU6)信号均为阳性，富集效率为100%，RNU6的PCR扩增曲线如图5所示。

图3 粪便脱落细胞内参基因(β-actin)PCR扩增曲线 Fig 3 PCR amplification curve of β-actin gene in fecal exfoliated cells

3 讨论

国内现有的关于粪便脱落细胞检测方法主要是运用离心淘洗、密度梯度离心、全粪便洗脱与免疫磁珠相结合的方法从粪便中提取脱落细胞后经HE染色涂片，进行病理学判断，敏感性低，可能与以下因素有关：受到肠腔内多种理化、生物学因素的影响，脱落细胞的形态发生多种改变；粪便中混有大量的细菌、食物残渣、胆色素及肠道黏液，使对细胞的分离和辨识存在一定的难度[7]。因此，单一的病理学诊断难以作为结直肠癌的诊断方法。

正常成人大肠黏膜上皮细胞以每小时1%的速度更新，每天大约有1×1010个正常的上皮细胞脱落，进入肠腔，最后随大便排出。结直肠癌的肿瘤细胞生长旺盛，以超过1×109/cm2的速率脱落，如能以适当的方法充分富集粪便中的肠道上皮脱落细胞，从细胞中提取诊断标志物进行结直肠癌和结直肠腺瘤检测，将大幅度地提高诊断的阳性率。近年来，学者们倾向于利用粪便中DNA的甲基化基因、micRNA作为诊断结直肠癌的标志物[12],但灵敏性和特异性高低不一，诊断意义低，这可能与细胞富集技术有关。

图4 RNA 电泳显示28s rRNA、18s rRNA

本次试验除改良了筛网淘洗法，还首次采用hNOK/hSef单克隆抗体-叶酸磁珠法富集结直肠中的粪便脱落细胞。细胞表面以负电荷居多，因此我们将纳米磁珠表面包被正电荷基团，吸附细胞，将细胞和黏液、粪渣等杂质区别开来。hNOK是新发现的酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，参与各脏器肿瘤的发生、侵袭、转移[13]。hSef是能够调节纤维细胞生长因子(FGF)信号通路的抑制因子，该通路在机体发育、血管生成和肿瘤发生、发展等过程中发挥重要作用，调节紊乱可导致某些癌症的发生[14]。根据hNOK和hSef的特点设计出抗原后免疫Balab/C小鼠，选取免疫反应最佳的小鼠，经过SP2/0融合、有限稀释法筛选、制备腹水等过程，获得hNOK和hSef的单克隆抗体[10]。本试验所用的hNOK和hSef单克隆抗体均来自清华大学医学院实验室，抗体滴度为1∶3 000，取得抗体后立即送至北京化工大学实验室进行单克隆抗体-叶酸纳米磁珠耦联操作，最终获得hNOK和hSef单克隆抗体-叶酸纳米磁珠。该方法的优势是，hNOK和hSef单克隆抗体利用免疫特性与细胞膜的抗原结合[14-15]。叶酸修饰的纳米材料通过结合肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体靶向肿瘤细胞，外加磁力可使其富集，正常细胞则不受干扰[16]；二者共同发挥与癌细胞结合的作用，大幅度提高富集细胞的效率。

图5 粪便脱落细胞中RNU6基因的PCR 扩增曲线 Fig 5 PCR amplification curve of RNU6 in in fecal exfoliated cells

在本研究中，qRT-PCR显示，平均Ct值为30时，所有样本均可见β-actin、RNU6信号均为阳性，富集效率均为100%，表明改良的粪便脱落细胞富集法有效率较高。通过粪便脱落细胞质量控制体系，我们可以得到含有稳定数量的消化道肿瘤细胞悬液，由此获得的细胞悬液，可进一步用以检测包含于肿瘤细胞中的潜在结直肠癌分子生物学标志物，为建立高准确性、无创性的结直肠癌筛查方法提供技术基础。

本实验首次建立了hNOK和hSef单克隆抗体-叶酸纳米磁珠富集粪便脱落细胞的技术体系，为粪便脱落细胞的高效富集提供了新的简单无创的方法，从而提高结直肠癌及癌前病变的非侵入性筛查的准确性。通过本实验我们建立了粪便脱落细胞质量控制体系，该体系能够简单、快捷地鉴定粪便脱落细胞质量。