不同程度的哮喘患者血浆氨基酸代谢组学特征的比较研究

古丽努尔·艾尼， 巴哈古力·阿卜都热合曼， 古扎力努尔·艾尔肯，热娜古丽·热依木， 巴吐尔·买买提明

(新疆医科大学1药学院药分教研室， 2中心实验室， 乌鲁木齐 830011)

支气管哮喘[1](bronchialasthama，BA)是由多种细胞如T淋巴细胞、肥大细胞以及气道上皮细胞等与细胞组分共同参与的慢性气道炎症性疾病，简称哮喘。尽管当前的医学水平对哮喘的治疗有了明显的提升，但整体死亡率依然没有下降。随着哮喘病死率的增加，如何防治和治疗哮喘，甚至做到个体化治疗这个问题，已受到相关专家的重视，早期发现并采取相应的措施，对支气管哮喘的防治具有很大的意义。哮喘称为慢性炎症性疾病，能导致易感者多种激发因子的气道高反应性，而引起气道狭窄即反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状。BA常在夜间或清晨发作[2]、加剧，经常出现广泛多变的可逆性气流受阻，多数病患可经治疗或自行缓解。哮喘根据严重程度可分为轻度间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘和严重持续性哮喘，这种分类目的在于避免在临床诊治过程中对哮喘病情的低估，并指导正确使用升降级治疗。

代谢组学研究对比健康状态与疾病状态下的小分子代谢物表达之间的差异，有利于对各类疾病及其早期诊断的生物特异性标志物的寻找[3-5]，能作用于治疗效果的评判[6]与疾病预后。代谢组学技术在诊断重大疾病上存在重要的作用，并且能将具体的疾病相关的代谢表型通路描述出来。伴随着代谢组学分析技术的日益发展，当前的分析技术已存在多种[7]，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)一直是代谢组学临床研究的常用技术，计算机信息技术和生化研究领域技术的突破使超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)逐渐取代了HPLC，HPLC以其高灵敏度、高分辨率、高分离性的优势，通过在特定环境中对生物体液及代谢物的研究，综合化学识别技术和生物分子学理论，对样本进行分离和图谱差异分析，揭示生物体的药理和机体功能状态，是新药研发、病理学研究、生化研究，为代谢组学样本的预处理与分析发挥重要的作用，对医药开发[9]和病理学研究需要具有积极的推动作用，在代谢组学中的应用地位不言而喻。

1 资料与方法

1.1研究对象收集新疆医科大学附属中医医院符合支气管哮喘诊断标准的哮喘患者(轻度哮喘组、中度哮喘组、重度哮喘组各25例)和健康体检者(健康对照组，30例)临床资料。根据严重程度对哮喘进行以下分级[8]：(1)轻度间歇性哮喘，主要症状为喘息、气急症状间歇性出现，发作时间为<1次/w，每次持续时间较短，夜间出现哮喘症状≤2次/月，患者在发作间期无症状，肺通气功能以及血气检查正常。FEV1≥正常预计值的80%，PEF变异率<20%；(2)轻度持续性哮喘，主要症状为发作时间为≥1次/w，但<1次/d，发作时将对活动以及睡眠状况造成影响，夜间出现哮喘症状≤2次/月。FEV1≥正常预计值的80%，PEF变异率为20%～30%；(3)中度持续性哮喘，发作时间≥1次/d，发作时将对活动以及睡眠状况造成影响，夜间出现哮喘症状>1次/w。FEV1≥正常预计值的60%，且<80%，PEF变异率>30%；(4)重度持续性哮喘，频繁发作，夜间发作次数≥1次/d，对睡眠造成严重的影响，日常生活受到明显制约。FEV1<正常预计值的60%，PEF变异率>30%。

哮喘的纳入标准：年龄(50±10)岁，与支气管哮喘的诊断标准相符合，曾经有哮喘发作史的非发作期患者和急性发作期和在急性发作期。排除标准：鉴别诊断为慢性咳嗽、气喘症状的其他肺部疾病如肺结核、肿瘤等；妊娠期或哺乳期妇女；合并心血管、糖尿病、肝肾疾病以及血液病等严重原发性疾病以及精神病患者；近期进行过大型手术的患者；合并发热以及感染的患者。

1.2采集样品采集各组晨起时的前臂经脉空腹血液，置入经过肝素处理过的离心管内，以4 000 r/min转速离心10 min，置-80℃冰箱保存。

1.3仪器与试剂超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC，Waters)，质谱(ACQUITY TQS，Waters)，色谱柱(ACQUITY UPLC BEH Amide，2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters)、-80℃超低温冰箱(海尔公司)，涡旋混匀仪(MS 3 basic，IKA)、超低有机物超纯水机(Milli-Q，Millipore)，超声波清洗机(200 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)、微孔滤膜(0.22 μm，上海半岛实业有限公司净化器材厂)、离心机(MULTIFUGEX-3R，Thermo Fisher)、-80℃超低温冰箱(海尔公司)。选取含16种氨基酸的混合标准品(waters，美国)，其中具体的组成成分为：半胱氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸；AccQ·Tag衍生化试剂(waters公司)、甲酸(色谱纯，天津市光复科技发展有限公司)、乙腈(色谱纯，Sigma-Aldrich)、水为超纯水。

1.4血浆的UPLC-MS检测

1.4.1 色谱条件 流动相分A、B两相：流动相A：水，含有0.1%甲酸；流动相B：乙腈，含有0.1%甲酸，梯度洗脱程序列入表1；洗针液：水∶乙腈(50∶50)，强洗针液：水∶乙腈(90∶10)，弱洗针液：水∶乙腈(10∶90)；柱温55℃，进样量为2 μL，样品室温度：10℃。MS条件：电离模式：ESI+；去溶剂气流速：1 000 L/h；锥孔气流速：150 L/h；去溶剂气温度：500℃；源温度：150℃，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 溶液的配置

1.4.2.1 标准品储备液的制备 取出Waters公司生产的氨基酸标准样品为多种氨基酸混合得到的溶液，每支安剖瓶含有的氨基酸种类为16种，各种氨基酸的浓度均为2.5 mmol/L(胱氨酸的浓度为1.25 mmol/L)，通过加入去离子水对标准样品进行稀释，氨基酸的含量为100 pmol/L，将最终得到的溶液放置在冰箱中备用，存放温度设置为4℃。

1.4.2.2 标准品系列浓度的制备 将去离子水稀释之后的标准溶液取出，通过加入水进行进一步的稀释，最终得到系列标准溶液，这些溶液的浓度依次为0.5、1、1.5、2、3、4 pmol/L。

1.4.2.3 衍生试剂制备 将AccQ·Tag衍生剂粉末放入2A瓶之中，并向其中加入1 mL的AccQ·Tag 2B，将2A瓶进行加盖，保证密封性，之后进行旋涡处理，时间设置为10 s，之后进行加热，温度设置为55℃，时间设置为10 min，保证溶液中的粉末已经充分溶解，最终得到的衍生化试剂浓度为10 mmol/L，将此试剂放置在干燥器中保存。

1.4.2.4 血浆样品前处理 将保存在冰箱里的血浆样品取出，并进行取样，保证每份样品的取样量为50 μL，量取450 μL乙腈，将乙腈与样品混合，并进行涡旋处理，以保证二者充分混合，在室温下静置10 min，以12 000 r/min离心，弃沉淀，取1支新Ep管，将50 μL上清移入其中，加入450 μL乙腈后进行离心处理，设置转速为12 000 r/min，温度为4℃，时间为15 min，并对上清进行过滤、保存。

1.4.2.5 标准品及样品衍生化反应 用微量移液枪取10 μL混标标准品(或样品)，取一支新EP管，将标准品(或样品)加入其中，量取70 μL，pH=8.8的硼酸缓冲液及20 μL衍生化试剂，加入其中，将三者混合均匀，并进行涡旋处理，室温条件下静置1 min，再使混合溶液在温度为55℃条件下反应10 min，进行过滤、装瓶，进行色谱分析。

2 结果

2.1方法学考察

2.1.1 专属性 在该色谱条件下，分别进样测定氨基酸混标对照品溶液和经前处理(衍生化处理)后血浆样品，各氨基酸标准品在9 min内完成有效分离(表2)，衍生化所用的各类试剂对样本中的16种氨基酸测定没有干扰，方法专属性良好，见图1、2。

2.1.2 氨基酸标准品的线性回归分析 配置浓度依次为0.5、1、1.5、2、3、4 pmol/L的混合氨基酸溶液，在已确定的色谱条件下进行线性回归分析，结果显示16种氨基酸在相应的线性范围的线性关系良好(r>0.993 0)，方法灵敏性良好。

表2 16种血浆氨基酸的出峰时间

2.1.3 回收率和精确度实验 实验结果显示，方法的回收率良好，氨基酸相对回收率为85%～115%；方法精密度良好，16种氨基酸日内RSD<15%，符合实验条件。

2.1.4 样品稳定性实验 配制0.5、1、1.5、2、3、4 pmol/L的氨基酸标准溶液，并配制后置于10℃环境下，于0、4、6、8、12、24 h进行测定，测得的氨基酸含量，在8 h之内无较大差异性，在24 h时检测，其含量变化很大。

2.1.5 样品重复性实验 重复性实验结果显示，经衍生后的血浆样品中14种氨基酸日内RSD<15%，符合实验条件。

图1 标准品衍生后的氨基酸图

图2 血浆衍生后氨基酸图

2.2血浆样本氨基酸含量分析结果与健康对照组比较，轻度哮喘组中的甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与健康对照组比较，中度哮喘组中的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、天门冬氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与健康对照组比较，重度哮喘组中的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸含量降低，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.3各组哮喘血浆代谢物图谱模式识别分析结果在SIMCA软件中，通过R2X、R2Y和Q2来表示实验过程中所建立模型的质量评价指标。其中R2是所理解的模型差异，Q2是所预测的模型差异。R2、Q2的值越接近于1，代表模型拟合度越好，越小代表模型拟合度越差，一般认为模型的预测结果达到“良”的标准必须要Q2>0.4。健康对照组和轻度哮喘组血浆氨基酸OPLS-DA分析结果显示，R2X=0.816，R2Y=0.991，Q2=0.861，2组血浆氨基酸存在差异性。健康对照组和中度哮喘组血浆氨基酸OPLS-DA分析结果显示，R2X=0.758，R2Y=0.913，Q2=0.888，说明两组血浆氨基酸存在差异性。健康对照组和重度哮喘组血浆氨基酸OPLS-DA分析结果显示，R2X=0.668，R2Y=0.949，Q2=0.937，2组血浆氨基酸存在差异性。平面散点图中横纵坐标表示2个主要成分，每一个点表示一个样本，2组之间无交叉，无重叠，存在差异性，见图3、4、5、6。

表3 血浆样品氨基酸浓度分布

注：与健康对照组比较，#P<0.05。

图3 轻度哮喘组与健康对照组血浆氨基酸的OPLS-DA分型图

图4 中度哮喘组与健康对照组血浆氨基酸的OPLS-DA分型图

图5 重度哮喘组与健康对照组血浆氨基酸的OPLS-DA分型图(●：重度哮喘哮喘患者；■：健康人)

图6 轻度、中度、重度哮喘组与健康对照组血浆氨基酸的OPLS-DA分型图

3 讨论

体内代谢包括糖代谢、脂肪代谢和能量代谢等三大营养物质代谢[10-11]。体内氨基酸的数量以及形态发生异常变化，将使代谢过程失去平衡，氨基酸代谢发生紊乱直接引起体内能量代谢[12]的紊乱，并且间接地对糖代谢以及脂代谢造成影响，进而对整个机体[13-14]的物质代谢水平(对机体内的细胞、激素及整体水平的调节)造成影响[15]，最终导致生命活动受到不同程度的干扰而患病。本研究发现，轻、中、重度哮喘患者氨基代谢酸与健康人比较有一定的差异，体内氨基酸代谢出现了严重紊乱。

在UPLC-MS法分析结果中，与健康对照组比较，轻度，中度，重度哮喘组血浆氨基酸含量有显著的差异，大部分氨基酸[10]在不同程度的哮喘组血浆内的变化趋势一致，即甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸3种氨基酸含量明显降低。这种变化趋势表明了轻度，中度，重度哮喘组体内的某些氨基酸代谢基本变化趋势是一致的，即不同程度的哮喘发病机制具有一定的相似性。同时中度和轻度患者血浆中氨基酸含量显著降低，而同样氨基酸在重度哮喘组血浆中的含量明显升高；与健康对照组相比，重度哮喘组血浆内亮氨酸明显升高，谷氨酸含量下降，而其氨基酸在轻度和中度哮喘组中未出现变化，不同程度哮喘代谢产物变化中重度哮喘组氨基酸变代谢紊乱最明显；与健康对照组比较，中度哮喘组血浆内脯氨酸含量下降，这种变化趋势表明同一种疾病，在不同程度的病程中代谢产物的紊乱程度是不一样的。哮喘病体内的能量代谢与营养物质的合成异常是哮喘反复发作的主要原因。天冬氨酸可以提供机体所需能量，是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸和嘌呤、嘧啶碱基的合成的前体。它参与鸟氨酸循环，促进氧和二氧化碳生产尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增强肝脏功能，而肝脏是身体内以代谢功能为主的器官，不同程度哮喘组检测结果中天冬氨酸明显下降，与肝脏功能受阻，机体未能正常代谢有着密切的关系。半胱氨酸不仅对范围广泛的毒性物质具有有效的解毒作用，而且有改善炎症的作用。当人体内半胱氨酸含量降低时增强因环境因素诱发哮喘的几率，也可能会因半胱氨酸含量降低而抵抗哮喘气道炎症的发生。丝氨酸作为一种非必须氨基酸，在脂肪代谢(脂肪和脂肪酸的[16-17]新陈代谢)及肌肉的生长中发挥作用，有助于抗体的产生，在维持健康的免疫系统中起到重要作用。哮喘患者体内丝氨酸的含量降低而阻止免疫系统的正常运作，这种紊乱可能是导致哮喘气道炎症的因素之一。苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸只在重度哮喘患者体内含量增加，在轻度和中度哮喘中含量降低。缬氨酸促使神经系统功能正常、可给人体肌肉提供额外的能量并产生葡萄糖，还能帮助肝脏清除多余的氮，预防肝脏毒素的积累，而黏附分子及神经调节机制中，一氧化氮(NO)是能引起支气管舒张的因子，表明缬氨酸与神经系统功的关系和哮喘病有密切的关系。苯丙氨酸在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢。能量代谢的异常影响肌肉、神经、合成、吸收以及体内的其他功能。而氨基酸在体内的异常，首先会影响代谢的某一个环节形成恶性循环，最终会导致重症疾病的发生。哮喘发作可能与这些氨基酸在体内紊乱相关。从以上氨基酸在轻度、中度和重度哮喘体内的变化规律可见，3种不同程度的哮喘体内氨基酸的变化有一定相似性而变化程度不一样。

超高效液相色谱作为代谢组学的重要研究工具之一，为代谢组学的样本预处理和分析发挥了重要作用，对医药开发和病理学研究起到积极的推动作用。在本研究中甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸等3种氨基酸在不同程度哮喘患者体内的变化趋势是一致的，即不同程度的哮喘发病机制可能具有一定的相似性。不同程度哮喘患者中，重度哮喘代谢产物的紊乱程度最明显，表明可以将代谢组学运用到寻找不同程度的哮喘疾病的相关特异性代谢产物之间的共性与差异性外，还可以应用到疾病严重程度判断中。研究成果可能为病理学研究具有一定的推动作用。