甲状腺癌组织自噬相关基因Beclin-1和LC3的蛋白表达及其临床病理学意义

王培成， 李晓荣， 刘新义， 王吉生

(1威海市市立医院耳鼻喉头颈外科； 2威海卫人民医院妇产科, 山东 威海 264200)

甲状腺癌是内分泌系统中常见的恶性肿瘤，发病率呈现出明显增高的趋势[1]，乳头状癌是其常见的病理类型。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象[2]。相关研究发现，自噬与多种肿瘤的发生、发展密切相关，微管相关蛋白/转链3(microtuble-associated protein/hight chain 3, LC3)作为一种自噬相关基因，已被作为是自噬表达水平的特异性方法之一[3]，目前LC3已作为自噬的标记性分子用于检测自噬。Beclin-1基因是哺乳动物参与自噬的特异性基因，作为肿瘤抑制基因，通过调控细胞自噬，从而达到维持机体内环境稳定的作用[4]。本研究从自噬的角度出发，阐明LC3和Beclin-1在甲状腺癌中的表达规律，对研究甲状腺癌的发生机制及临床干预具有重要意义。

1 资料与方法

1.1临床资料收集2013-2016年威海市市立医院甲状腺外科手术切除的甲状腺癌63例标本，其中男性17例，女性46例，年龄17～67岁，平均63.4岁。所选病例术前未经任何辅助治疗，临床病理资料完整。病理资料经两位病理专家病理学检查确诊为甲状腺癌。以距肿瘤边缘5 cm以上的组织定义为配对癌旁组织。收集同期住院的甲状腺腺瘤(42例)和结节性甲状腺肿病例(31例)，均经病理学检查确诊。所有标本的使用均经我院伦理委员会同意，取得患者或家属的知情同意。标本经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片后行免疫组化检测。每例标本切片厚约4 μm。

1.2主要仪器与试剂石蜡切片机、显微镜(日本OLYMPUS)、电恒温箱、微波炉。苏木精，免抗人Beclin-1和LC3多克隆抗体(Abcam公司)，免疫组织化学SP试剂盒和DAB试剂盒购自上海生物工程有限公司。

1.3方法采用免疫组织化学SP法检测上述标本中Beclin-1和LC3抗体的表达情况，具体免疫组化操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判定Beclin-1和LC3蛋白阳性染色主要定位于细胞质，由2位病理医师对切片进行阅片，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，每个视野计数200个细胞，以胞质或胞核染为淡黄色至棕褐色为阳性标准。阳性细胞表达率：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。以0～1分为阴性，2分及以上为阳性。

2 结果

2.1Beclin-1和LC3在甲状腺癌、腺瘤、甲状腺肿及癌旁正常组织中的表达情况Beclin-1和LC3蛋白阳性表达主要定位于胞质，偶见细胞核着色，呈明显的淡黄色或棕褐色颗粒。Beclin-1和LC3蛋白在甲状腺癌及癌旁正常组织中的表达见图1～图4。

各组织Beclin-1的表达差异有统计学意义(P<0.05)。甲状腺癌中Beclin-1蛋白的表达率为39.68%(25/63)，甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿和癌旁正常组织中Beclin-1的阳性表达率分别为69.05%(29/42)、83.87%(26/31)和85.71%(54/63)。甲状腺癌中Beclin-1表达的阳性率明显低于甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿和癌旁正常组织(P<0.05)。LC3蛋白在甲状腺癌的阳性表达率为74.6%(47/63)，在甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为40.48%(17/42)、38.72%(12/31)和50.94%(27/63)。在甲状腺癌中LC3表达低于以上正常的3种组织。4者比较Beclin-1的表达差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 Beclin-1在癌旁正常甲状腺中的阳性表达 图2 LC3在癌旁正常甲状腺中的阳性表达 图3 Beclin-1在甲状腺癌中阴性的表达 图4 LC3在甲状腺癌中的阴性表达

表1 Beclin-1、LC3在甲状腺癌、腺瘤、甲状腺肿及癌旁正常组织中的表达/例(%)

2.2LC3和Beclin-1的表达与甲状腺癌临床病理特征之间的关系LC3蛋白表达与甲状腺癌患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型及有无颈部淋巴结转移各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Beclin-1蛋白表达与其性别、年龄及肿瘤大小各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Beclin-1蛋白的表达与颈部淋巴结转移有关，有淋巴结转移的甲状腺癌Beclin-1蛋白阳性表达率明显低于未发生淋巴结转移的患者(χ2=8.433，P=0.000)，见表2。

表2 Beclin-1和LC3的表达与甲状腺癌临床病理特征之间的关系/例

2.3LC3与Beclin-1在甲状腺癌中的表达的相关性经Spearman相关性检验分析，在甲状腺癌中LC3与Beclin蛋白成正相关(r=0.272，P=0.031)，见表3。

表3 Beclin-1和LC3在甲状腺癌表达的相关性分析/例

3 讨论

自噬与肿瘤关系的研究已成为研究热点。自噬是细胞内物质代谢的重要途径，是单细胞生物、植物和哺乳动物细胞中广泛存在的降解/再循环系统的重要组成部分，是一种高度保守的自我破坏性过程，可以表现为分解功能障碍或不必要的细胞成分。研究发现，抑癌基因对自噬起促进作用，可诱导自噬，而癌基因对自噬产生抑制作用[4]。提示自噬可以抑制肿瘤的生长，而抑制自噬可促进肿瘤生长。

Beclin-1基因首先被Levine等发现，位于人类染色体17 q21，是酵母Atg6/Vps30的同源物，在自噬和液泡蛋白分选中发挥作用[5]。Beclin-1在人类癌症发病机制中起关键作用，但其在不同癌症中的表达和功能，即使在同一癌症的不同阶段也不一致。例如，相关研究表明，Beclin-1的高表达与非霍奇金淋巴瘤、唾液腺癌和胃癌患者的总体生存率高有关，Beclin-1阳性患者的子宫内膜癌生存率明显优于Beclin-1阴性者，推测Beclin-1可作为判断外阴鳞状细胞癌预后的生物标志物[6]。Zhao等[7]在手术的结肠癌组织中检测Beclin-1在结肠癌标本中的表达，发现其在转移性结肠癌中低表达。

本研究采用免疫组化的方法研究自噬相关基因Beclin-1在甲状腺癌及癌旁组织中的表达情况，发现其蛋白在甲状腺癌组织中的表达染色普遍呈阴性，而在甲状腺癌旁组织及中，染色呈明显棕黄色。Beclin-1蛋白在癌旁组织、甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿中的阳性表达率高于甲状腺癌组织，经比较差异有统计学意义(P<0.05)。Beclin-1蛋白在甲状腺癌中表达下降，提示其可降低细胞的自噬反应，不能对自噬肿瘤细胞的死亡起促进作用，可促进肿瘤的发生和发展。另外，进一步研究Beclin-1的表达与甲状腺癌的临床病理特征发现其与颈淋巴结转移有关，发生颈淋巴结转移的甲状腺癌患者其表达阳性率明显低于未发生经淋巴结转移者。由此可推测Beclin-1在甲状腺癌转移过程中起抑制作用。本研究并未发现Beclin-1与甲状腺癌的临床分期有关，是否与甲状腺癌的预后有关，还需要随访资料的支持，后期研究可继续探讨其表达与甲状腺癌患者预后的关系。

微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)家族包括3种同种型(LC3A，LC3B和LC3C。LC3的表达强度与自噬活性密切相关，现已作为自噬体的特异性标记蛋白[8]。眭怡群等[9]研究显示，LC在大肠癌中的阳性率高于大肠腺瘤和正常大肠黏膜(P<0.05)，且与大肠癌的组织学分化程度有关，提示自噬相关基因LC3在大肠癌的发生、发展中起协调作用。本研究与其结果相反，LC在甲状腺癌中的阳性表达低于其它3种甲状腺良性疾病、癌旁组织，可能与组织类型不同有关。陈小林等[10]通过免疫组织化学染色方法检测到LC在甲状腺癌组织中的含量最低，并且显著低于癌旁甲状腺组织，在发生转移的淋巴结组织中LC3含量低于正常淋巴结组织，本研究结果显示，LC与甲状腺各病理特征中的关系中，与其颈部淋巴结转移无关，后续应扩大样本进行进一步的研究。LC3在甲状腺癌中的表达下调，与卢秀波等[11]研究结果相类似，提示自噬活性的下调可能与甲状腺癌的发生发展有一定关系。

恶性肿瘤的发生、发展受到多种基因，多种调控网络的调控，在本研究中经Spearman相关检验发现，Beclin-1蛋白与LC3蛋白在甲状腺癌中的阳性表达呈正相关(r=0.272，P<0.05)，提示自噬的两种蛋白在调控甲状腺癌的发生、发展中关系密切，在肿瘤的发生发展过程中起作用。

综上所述，基于本研究对Beclin-1和LC3在甲状腺癌中低表达的发现，Beclin-1、LC3可为甲状腺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点。