香青兰总黄酮对H2O2诱导的U87细胞损伤的保护机制研究

郑瑞芳， 曾 诚， 都研文， 姜 雯， 江 静， 邢建国

(1新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆维吾尔自治区药物研究所， 乌鲁木齐 830004； 3新疆医科大学第六附属医院药剂科， 乌鲁木齐 830002； 4石河子大学药学院， 新疆 石河子 832000)

缺血性脑卒中是当今世界最具神经系统破坏性的疾病之一，脑卒中目前为止还没有有效的治疗药物，其导致神经系统损伤的病理机制尚不明确，寻找有效的生物靶点，研发理想的治疗药物尤为迫切[1-3]。香青兰为唇形科青兰属植物香青兰(DracocephalumMoldavicaL.)的干燥地上部分，分布于我国东北、西北和华北等地区，在新疆资源特别丰富,已从香青兰中分离得到黄酮类、三萜类、甾体类、苯丙素类、环烯醚萜类和多糖等化学成分，具有抗心肌缺血、益心护脑、抗氧化、抗炎和降压等功效，临床主要用于治疗心脏病、 高血压、寒性神经性头痛、寒性感冒、气管炎等[4]。本课题组前期研究表明黄酮类化合物是香青兰有效部位，对脑卒中有较好的效果[5]。本研究采用CCK-8试剂盒法、活性氧(ROS)检测试剂盒法和Western blot法，探究香青兰总黄酮对氧化应激诱导U87细胞损伤的保护作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器DV215CD型电子分析天平( 瑞士梅特勒公司)，BDS-FL型荧光倒置显微镜(奥特光学仪器)， HERA cell-150i型 CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)，SW-CJ-1B型超净工作台(上海诺萱科学仪器有限公司)，PK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏仪器有限公司)。

1.2试药香青兰总黄酮(实验室自制，20170715)；U87细胞(中国医学科学院生物技术研究所惠赠，批号20170128)；gibco胎牛血清(上海江林生物科技有限公司，批号1932595)； 0.25%胰酶(美国Thermo公司，批号J180003)；DMEM高糖培养基(美国Thermo公司，批号AD17497265)；CCK-8检测试剂盒(中国博士德生物工程有限公司，批号13C21C60)；P-p44/p42MAPK抗体(美国CST生物公司，批号4370S)；p44/p42MAPK抗体(美国CST生物公司，批号9107S)；GAPDH蛋白[艾博抗(上海)贸易有限公司，批号 18AFO0403]。

1.3药材香青兰药材2016年7月采集于新疆维吾尔自治区吉木萨尔县，经新疆维吾尔自治区药物研究所民族药研究室何江副研究员鉴定为为唇形科青兰属植物香青兰(DracocephalumMoldavicaL.)的干燥地上部分。

1.4香青兰总黄酮的制备取香青兰药材粗粉，加入20倍量的40%乙醇回流提取3 h，滤过，取上清，减压浓缩至0.125 g/mL。按大孔吸附树脂柱床体积∶药液比例为2∶9，以流速1.5 BV/h通过HPD100型大孔吸附树脂柱，静置吸附6 h后，用4 BV水以流速3.0 BV/h洗脱，弃去洗脱液，再用6 BV 70%乙醇溶液以流速2.0 BV/h洗脱，收集洗脱液，将所收集的70%乙醇洗脱液, 减压浓缩至相对密度为1.22～1.25(60℃)的清膏，喷雾干燥，即得。

1.5细胞培养U87细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基于在37℃、5%CO2的培养条件下培养，当细胞融合度达到85%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化细胞，以1∶2的比例进行传代，每隔2～3天传代1次，取对数生长期的细胞接种于培养板中进行后续实验。

1.6模型的建立与分组

1.6.1 H2O2损伤模型的建立 选用U87细胞来模拟缺血性脑卒中神经细胞损伤，取对数生长的U87细胞，按实验所需种于不同的培养板中待完全贴壁后，弃去原培养基，加入H2O2处理20 min模拟氧化应激，随后用冷的PBS洗2遍，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，即得H2O2损伤模型细胞。

1.6.2 细胞分组 对照组U87细胞不给任何药物预处理，同时也不经历氧化应激过程；模型组U87细胞不给任何药物预处理，只进行氧化应激处理；实验组U87细胞给予不同浓度香青兰总黄酮预处理2 h，再进行氧化应激处理。

1.7香青兰总黄酮对U87细胞毒性影响将处于取对数生长期的U87细胞1×105个接种于96孔培养板中，待细胞完全贴壁后，分别更换含不同浓度香青兰总黄酮(200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL)的DMEM高糖完全培养基100 μL。对照组更换正常DMEM高糖完全培养基，48 h后用CCK-8试剂盒检测OD值计算细胞存活率。

1.8不同H2O2浓度对U87细胞存活率的影响将处于取对数生长期的U87细胞1×105个接种于96孔培养板中，待细胞完全贴壁后，分为5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 mmol/L 浓度H2O2组，对照组更换正常DMEM高糖完全培养基，(均含1%DMSO)，待造模结束后，用CCK-8试剂盒检测OD值计算U87细胞存活率。

1.9不同预给药时间对U87细胞存活率的影响将处于取对数生长期的U87细胞1×105个接种于96孔培养板中，待细胞完全贴壁后用100 μg/mL 香青兰总黄酮的DMEM高糖培养基100 μL，分别预处理U87细胞48、36、24、12、10、8、6、4、3、2.5、2、1.5、1 h。模型组和对照组加入等体积的不含药的DMEM高糖完全培养基(均含1%DMSO)，除正常组外其他组均给予氧化应激处理，用CCK-8试剂盒检测OD值计算U87细胞存活率。

1.10不同预给药浓度对U87细胞存活率的影响将处于取对数生长期的U87细胞1×105个接种于96孔培养板中，待细胞完全贴壁后分别用浓度200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL的香青兰总黄酮DMEM高糖培养基100 μL，预处理U87细胞2 h。模型组和正常培养基组加入等体积的不含药的DMEM高糖完全培养基(均含1%DMSO)，除正常组外其他组均给予氧化应激处理，用CCK-8试剂盒检测OD值计算U87细胞存活率。

1.11香青兰总黄酮对H2O2刺激U87细胞引起的ROS过量生成的影响将处于取对数生长期的U87细胞1×105个接种于6孔板中，待融合度达到80%以上，用含100、50、25、5 μg/mL浓度香青兰总黄酮的DMEM高糖完全培养基处理U87细胞2 h，随后进行氧化应激造模，造模结束后，弃去培养基，用PBS洗2遍，分别加入10 μmol/L的DCFH-DA工作液1 mL于6孔板中，37℃下避光孵育30 min，弃去培养基，用不含胎牛血清的DMEM高糖培养基清洗3遍，荧光酶标仪检测细胞内荧光强度，激发波长488 nm，检测光波长525 nm；以只加DCFH-DA探针的细胞为阴性对照，实验重复3次，用DCF的平均荧光反映细胞内活性氧的水平。

1.12Westernblot检测P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK蛋白水平将对照组、模型组、实验组细胞按“1.6.1”项下方法处理，加入含有苯甲基酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF) 的裂解液，放在冰上裂解反应30 min，在-4℃以12 000 r/min离心 20 min，吸取蛋白上清液至EP管中。二喹啉甲酸 ( Bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量试剂盒检测提取的蛋白浓度。将蛋白样品与 5×loading buffer( 4∶1) 充分混合后，放在100℃煮沸5 min。蛋白凝胶上样孔中每孔加入15 μL的变性蛋白样品，0.6A/4块胶电泳至结束，凝胶蛋白在4℃、100V电压下转膜30min。用7%脱脂奶粉封闭1h后分别孵育P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK一抗(稀释1 000倍，-4℃孵育过夜)，用辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗1 h，显影，曝光。

2 结果

2.1香青兰总黄酮对U87细胞毒性分别用200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μg/mL 9个浓度刺激U87细胞48 h，结果9个浓度的香青兰总黄酮溶液对U87细胞存活率均没有影响，表明有效浓度的香青兰总黄酮对U87细胞没有毒性，见图1。

图1 香青兰总黄酮对U87细胞的毒性

2.2不同H2O2浓度对U87细胞存活率的影响分别用5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 mmol/L 6个浓度的H2O2溶液损伤U87细胞20 min，当H2O2浓度大于0.31 mmol/L时，可引起U87细胞损伤，因此确定H2O2损伤浓度为0.31 mmol/L，见图2。

2.3不同预给药时间对U87细胞存活率的影响用100 μg/mL香青兰总黄酮溶液分别预给药48、36、24、12、10、8、6、4、2、1 h，用浓度为0.31 mmol/L H2O2损伤20 min造模，结果香青兰总黄酮预给药时间为2 h时，U87细胞存活率最高，因此香青兰总黄酮预给药时间定为2 h,见图3。

图2 不同H2O2浓度对U87细胞存活率的影响

图3不同预给药时间对U87细胞存活率的影响

2.4不同预给药浓度对U87细胞存活率的影响分别用200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL 8个浓度的香青兰总黄酮溶液预给药2 h，用浓度为0.31 mmol/L H2O2损伤20 min造模，结果浓度为12.5 mmol/L 的香青兰总黄酮溶液U87细胞存活率最高，见图4。

图4 不同预给药浓度对U87细胞存活率的影响

2.5不同浓度药物预处理对H2O2刺激U87细胞引起的ROS过量生成的影响与对照组比较，模型组ROS水平增高，不同浓度香青兰总黄酮溶液可抑制ROS的产生,见图5。

2.6Westernblot检测P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK蛋白水平与对照组比较，模型组U87细胞P-p44/p42MAPK表达受到抑制，实验组不同浓度的香青兰总黄酮均可升高P-p44/p42MAPK蛋白的表达,且呈现剂量依赖性,见图6。

图5 不同药物预处理对H2O2刺激U87细胞引起的ROS过量生成的影响

3 讨论

氧化应激脑缺血/再灌注(I/R)损伤过程中最常见的损伤，也是导致神经元细胞损伤和神经退行性疾病如动脉粥样硬化、阿尔兹海默症、脑卒中等的主要原因，保护星形胶质细胞在氧化应激条件下的生存活力是减少神经元死亡，减少梗死面积的关键。黄酮类化合物已被提出在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病中发挥作用[4-6]。黄酮类化合物在血脑屏障(BBB)中有很好的报道，并已在大脑中检测到，如海马、大脑皮层、小脑和纹状体[7-10]，它们对学习和记忆的形成很重要，与此同时也被衰老和神经退化所损害。越来越多的人观察到，总黄酮通过调节细胞信号转导途径发挥保护细胞的作用，如原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路。激酶和磷酸酶之间的平衡和高度动态相互作用对于控制细胞内信号传导是至关重要的，因此蛋白激酶和磷酸酶的异常调节可能在诸如糖尿病和神经系统疾病等疾病中起作用[11]。

本课题组首次发现香青兰总黄酮对神经元氧化应激损伤的保护作用，H2O2对U87细胞的氧化应激损伤呈浓度依赖式，且损伤时间对其损伤程度影响较大，香青兰总黄酮预处理可减弱H2O2诱导的U87细胞的细胞损伤，减少ROS的产生，抑制细胞凋亡起到抗氧化作用。细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)被称为经典MAP激酶，其响应于应激信号而被激活。既往研究发现脑卒中患者脑内磷酸化ERK1/2/MAPK水平与氧化应激相关，氧化应激过程中P-ERK1/2被激活，通过阻断细胞凋亡来对抗氧化应激引起的细胞损伤[12-17]。实验结果表明，香青兰总黄酮通过激活P-ERK1/2来保护神经元细胞免受氧化应激。在氧化应激或缺氧过程中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路被激活，对细胞外刺激起反应，并调节各种细胞活性，如分化、增殖、存活和凋亡。与模型组相比香青兰总黄酮干预组的细胞ROS含量降低，P-ERK1/2蛋白含量均明显高于模型组，且呈现剂量依赖，表明香青兰总黄酮通过激活P-ERK1/2通路，抑制ROS过量产生，从而起到拮抗H2O2对U87细胞增殖的抑制作用。这种神经保护特性表明，香青兰总黄酮可以作为神经退行性疾病的潜在治疗剂，研究结果可为香青兰总黄酮治疗神经退行性疾病的药物开发提供参考。