不同品种烟草对Cd的富集及根际有机酸的分泌特征

余 浩，王幽静，宋 睿，潘彦硕，王长青，刘炳杉，李本银，李烜桢*

（1.河南农业大学林学院，郑州 450002；2.河南农业大学生命科学学院，郑州 450002；3.华南农业大学材料与能源学院，广州510642；4.河南农业大学现代实验技术管理中心，郑州 450002；5.河南农业科学院植物营养与资源环境研究所，郑州 450002）

随着社会不断发展，土壤污染问题越来越严重，其中土壤重金属污染问题尤其突出。据统计，我国受重金属污染的耕地占总耕地面积的五分之一，其中Cd污染最为严重[1]。土壤受Cd污染后，会通过生物富集作用进入人体，危害人体健康。目前土壤重金属污染修复方法主要有物理、化学和生物方法等，但物理和化学方法修复成本高，并且会在一定程度上破坏土壤结构，容易造成二次污染，因此不适用于农田污染治理[2-3]。植物修复技术因具有成本低、环境友好等优势而被广泛应用于农田土壤重金属污染的修复[4]。

目前发现的Cd超积累植物，如有翅星蕨（Microsorum pteropus）、遏蓝菜（Thlɑspi cɑerulescens）等，多因生长缓慢、生物量低、栽培困难等较难应用于实际[5-6]。烟草是世界上较广泛种植的一种作物，其生物量大，并且对重金属有较强的吸收和积累能力，因此烟草可能被用于土壤重金属污染的修复[7]。张艳玲等[8]研究了497份烤烟样品的重金属含量发现，烟草中Cd含量远高于其他重金属，叶片平均Cd含量为2.95 mg·kg-1，最高可达19.35 mg·kg-1。烟草对Cd的吸收积累能力品种间差异明显，刘登璐等[9]对93个烟草品种的Cd耐受性进行评价，发现了“达白一号”、“长脖黄”等多个对Cd具有高积累特性的品种。目前关于烟草富集重金属的研究不多，且大都集中在筛选Cd的低积累品种用于烟草栽培，而很少有人从环境角度考虑将烟草用于土壤重金属污染的修复。

本研究以来源广泛的7个烟草品种为供试材料，采用盆栽实验方法，研究了Cd胁迫下不同品种烟草的生长状况，探索了Cd在烟草不同器官的分布规律，初步筛选了对Cd富集能力强的品种，还研究了Cd胁迫下烟草根际有机酸的分泌特征，以期为Cd污染土壤的现实修复提供依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

烟草品种为中烟100、粤烟96、NC628、K326、长脖黄、云烟87和8326，均由河南农业大学科教园区提供。供试土壤采自河南农业大学校园，土壤类型为褐土，采样深度为0～20 cm，将土壤风干后，去除动植物残渣、碎石，过2 mm筛，备用。

土壤pH采用水浸提，微机型酸度计（杭州齐威仪器有限公司）测定（水∶土=2.5∶1）；有机质采用重铬酸钾容量法检测；速效磷采用NaHCO3溶液浸提，钼锑抗比色法检测；速效钾采用醋酸铵浸提，火焰光度计（上海傲谱）检测；碱解氮采用碱解扩散法检测；全Cd采用微波消解（美国CEM），原子吸收分光光度计检测（日本日立公司Z-2000）。所用试剂均为优级纯，供试土壤基本性质见表1。

表1 供试土壤的基本性质Table 1 Basic properties of the experimental soil

1.2 实验处理

实验于河南农业大学气候室进行，向土壤（过2 mm筛）中添加CdCl2粉末（无结晶水），采用“二分法”混土，将652 mg CdCl2粉末混于40 kg土中（理想条件下混合后Cd含量接近10 mg·kg-1）；先将163 mg CdCl2粉末和200 g土小范围均匀混合，再加入163 mg CdCl2和200 g土继续均匀混合，连续添加将652 mg CdCl2混于1 kg土中；再按照上述方法将含有Cd的1 kg土与39 kg土混合。平衡一周后，5点取样法取样，测定Cd含量为9.4 mg·kg-1，分装。每个烟草品种均设5个重复，以不种烟草作为对照。基肥（烟草专用肥不含Cd）与土壤均匀混合后装入塑料盆钵中，选择生长状况均匀一致的烟苗（四叶一心）移栽，每盆1.0 kg土定植一株。每天光照10 h，温度28℃；夜晚14 h，温度18℃；湿度为70%。

1.3 样品采集与测定

烟株移栽30 d后采集样品，先用抖土法[10]去掉非根际土，然后用毛刷将附着在根系周围的土壤轻轻刷下来作为根际土，保存至-20℃冰箱备用。随后将去土后的烟株用蒸馏水润洗，再用去离子水反复冲洗干净，用不锈钢剪刀将根、茎、叶分开，于105℃下杀青30 min，65℃烘干至恒质量并称量，经微波消解[11]后，赶酸，转移并定容至25 mL，用乙炔-火焰原子吸收光谱法测定烟草中Cd含量。

有机酸测定：测定根际土壤中草酸、苹果酸、柠檬酸、甲酸和乙酸的含量，有机酸均为色谱纯。称取根际土壤样品5 g于25 mL离心管中，加10 mL 0.1%的H3PO4水溶液，振荡3 min 后，在 5000 r·min-1转速下，离心5 min。过水相0.45 μm滤膜，用高效液相色谱仪（美国Agilent公司）检测。色谱条件：流动相为0.01 mol·L-1磷酸缓冲液（pH=2.7）；进样量为20 μL；流速0.5 mL·min-1；柱温 30 ℃；检测波长210 nm[10]。

根富集系数=烟草根Cd含量/土壤Cd含量

茎富集系数=烟草茎Cd含量/土壤Cd含量

叶富集系数=烟草叶Cd含量/土壤Cd含量

去除率=（根Cd含量×根生物量+茎Cd含量×茎生物量+叶Cd含量×叶生物量）/（土壤Cd含量×土壤质量）×100%

1.4 数据分析

试验结果用Excel 2016处理，SPSS17.0显著性分析，Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种烟草生物量的差异

本研究通过盆栽实验比较了Cd胁迫下不同品种烟草生物量（干质量）的差异（图1），在土壤Cd含量为9.4 mg·kg-1条件下，不同品种烟草生物量呈现叶＞茎＞根的趋势。“长脖黄”根、茎和叶的生物量均最大，分别为1.17、1.45 g和4.3 g，“长脖黄”叶的生物量与其他品种间差异达显著水平（P＜0.05）。

图1 不同品种烟草生物量Figure 1 Tobacco biomass of different varieties

2.2 不同品种烟草根、茎和叶Cd含量

通过检测烟草根、茎和叶中的Cd含量发现（图2），“云烟87”叶 Cd含量最高，达 64.67 mg·kg-1，其次为“8326”和“长脖黄”；“长脖黄”茎Cd含量最高，达27.1 mg·kg-1，其次为“中烟100”和“云烟87”；“8326”根Cd含量最高，达 23.75 mg·kg-1，其次为“粤烟 96”和“NC628”。不同器官的Cd含量均呈叶＞茎＞根的趋势，例如“长脖黄”根、茎、叶Cd含量分别为14.3、27.1、63.02 mg·kg-1。烟草叶片中Cd含量远高于根和茎，这种现象说明烟草生长期间对Cd有较强的转移能力。

图2不同品种烟草根、茎和叶Cd含量Figure 2 Cd concentration in roots，stems and leaves of different varieties of tobacco

2.3 不同品种烟草对Cd的富集系数

图3 显示“云烟87”叶对Cd的富集系数最高达6.88，其次为“8326”（6.77）和“长脖黄”（6.7）；“长脖黄”茎对Cd的富集系数最高达2.88，其次为“中烟100”（2.84）和“云烟 87”（2.82）；“8326”根富集系数最高达2.53，其次是“粤烟96”（1.81）和“NC628”（1.54）。烟草不同器官富集系数均呈现叶＞茎＞根。Baker[12]认为，超累积植物富集系数远大于1，而排斥型作物富集系数通常小于1。以此标准判断，在9.4 mg·kg-1条件下，烟草不同器官对Cd的富集系数均大于1，其中烟草品种“云烟87”叶对Cd的富集系数达到6.88，说明烟草对Cd有比较强的富集能力，有望用于实际土壤Cd污染修复中。

图3 不同品种烟草对Cd的富集系数Figure 3 Enrichment coefficient of different varieties of tobacco to Cd

2.4 不同品种烟草对Cd的去除率

修复植物对土壤中重金属的去除率是评价植物修复能力的最终指标。本研究发现“长脖黄”对Cd的去除率最高为3.48%，“NC628”对Cd的去除率最低为2.21%，两者相差36.5%，差异达显著水平（P＜0.05）（图4）。杨勇等[6]通过盆栽实验比较超富集植物印度芥菜、遏蓝菜和高生物量植物烟草对土壤中Cd的去除率，发现在1.0 kg土中生长60 d后，烟草对Cd的去除率远高于遏蓝菜和印度芥菜。

图4 不同品种烟草对Cd的去除率Figure 4 Cd removal rate of different varieties of tobacco

2.5 Cd胁迫下不同品种烟草根系分泌的有机酸

本文研究了不同品种烟草根际土壤5种有机酸含量，发现不同品种烟草根际土壤中均检测到了草酸；除粤烟96外，其他烟草品种根际土壤均检测到了乙酸，“中烟100”和“粤烟96”根际土壤中检测出少量苹果酸；“粤烟96”和“8326”根际土壤中检测出少量甲酸；在对照土壤中检测出少量的草酸、苹果酸和乙酸（表2）。不同品种烟草根际土壤中检测出草酸的含量均远高于其他酸，其中“长脖黄”分泌的草酸含量最高达 16.23 mg·kg-1，“NC628”最低为 10.2 mg·kg-1，差异达到显著水平（P＜0.05）；“NC628”乙酸含量最高为 0.31 mg·kg-1，“云烟 87”乙酸含量最低为 0.2 mg·kg-1，差异达到显著水平（P＜0.05）（表2）。

3 讨论

有学者[13]研究了多种高生物量植物对重金属的富集能力，发现用于植物修复技术的植物种类不一定局限于超富集植物，寻找与开发大生物量、富集重金属能力强的修复植物是首要任务。从图1看出烟草品种“长脖黄”生物量比其他品种大，且生长过程中未出现明显毒害现象。本研究为室内控制实验，烟草的生长期为30 d，因此生物量比大田生长的小。在大田生长条件下，“长脖黄”属于高产品种，据报道其仅烟叶产量（干质量）可达3000 kg·hm-2，因此具备了进行土壤重金属污染修复的先决条件[14-15]。

本试验研究表明（图2）不同品种烟草对Cd均有较强的富集能力，并且叶片为烟草储存Cd的主要场所，这与其他研究结果类似，例如袁祖丽[16]通过盆栽试验发现，当土壤中Cd的添加量达到10 mg·kg-1左右时，烟草叶片Cd含量高于根；贺元等[17]通过盆栽实验发现Cd含量在4.8 mg·kg-1下烟草叶片中的Cd含量（110 mg·kg-1）显著高于茎（25 mg·kg-1）和根（12 mg·kg-1）。其他植物类似，如朱艳霞[18]发现，Cd胁迫下东南景天不同部位 Cd含量为叶（180 mg·kg-1）＞茎（100 mg·kg-1）＞根（80 mg·kg-1）。有研究表明植物叶片的叶肉细胞在植物对Cd的解毒过程中起主要作用，这是因为Cd主要区隔在液泡和细胞壁等代谢不活跃的部位。在叶肉细胞中有大型液泡，液泡中富含蛋白质、有机酸和巯基化合物等都能与重金属结合降低重金属毒性；细胞壁中如木质素和各类蛋白等也能与重金属结合，因此烟草叶片的Cd含量高于根和茎[19-21]。

富集系数是衡量植物对重金属积累能力的一种重要参考标准，富集系数越大，说明植物对重金属的吸收能力越强[22]。从图3发现不同品种烟草均对Cd有较强的吸收能力。从烟草与超富集植物对Cd的去除率比较发现，将高生物量、高富集能力的烟草品种“长脖黄”用于土壤Cd污染修复是可行的。

根系分泌的有机酸可能是影响植物吸收重金属的重要因素[23]。本研究发现，烟草品种“长脖黄”对Cd的去除率最高，同样根际土壤草酸含量也最高，“NC628”去除率最低，根际土壤草酸含量也最低，因此可以推测，在Cd胁迫下烟草根系分泌较多的低分子量有机酸尤其是草酸可能是烟草对Cd具有较高富集能力的原因之一，这可能与有机酸的解离程度有关。草酸的解离常数高，更容易解离和释放H+，一方面降低了土壤pH，增加Cd的有效性；另一方面与土壤中的Cd螯合，促进了土壤中重金属的释放和烟草对重金属的吸收[24-26]。

表2 Cd胁迫下不同品种烟草根系对有机酸的分泌（mg·kg-1）Table 2 Secretion of organic acids from different tobacco roots under Cd stress（mg·kg-1）

4 结论

（1）在Cd胁迫下，7种供试烟草品种中“长脖黄”对Cd的去除率最高，因此，该品种有望成为一种新的Cd污染土壤的修复植物。

（2）不同烟草品种均分泌了草酸，其次为乙酸。在Cd胁迫下烟草根系分泌较多的低分子量有机酸尤其是草酸可能是烟草对Cd具有较高富集能力的原因之一。