Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）对水稻根伸长抑制的生态毒性研究

朱婷婷，王玉军，周东美，施维林，党 菲

（1.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009；2.中国科学院南京土壤研究所土壤环境与污染修复重点实验室，南京210008）

锑（Sb）是人体和植物的非必需元素，具有潜在的慢性毒性和致癌性[1]。Sb会抑制植物发芽和生长，抑制光合作用，影响膜结构和通透性[2]。Sb通过呼吸、饮食或皮肤等暴露途径进入人体后，不仅干扰体内糖与蛋白质的代谢，损害心脏、肝脏及神经系统，还会对黏膜产生刺激作用[3]。由于Sb具有较好的阻燃性，能增加子弹的硬度等特性，广泛应用于各行各业，人类对Sb的需求量越来越大，使得Sb矿的开采等活动急速增加。我国是世界上最大的Sb资源大国，储存量和产量均居于世界首位，且多年Sb产量达到世界总产量的80%[4]。近年来，随着含Sb矿产的大量开采，Sb矿周边土壤受到严重污染。Sb环境污染问题已经引起广泛的重视，目前国内外对Sb的生态毒理研究主要集中在植物、藻类对Sb的吸收[5]和积累过程[6-7]以及Sb对植物、藻类光合作用的胁迫[8]等，总体来说研究比较散，不够系统，由于缺乏系统性的生态毒性阈值研究，迄今为止，我国还未颁布关于Sb的土壤环境标准，因此开展Sb生态毒性和阈值研究就显得尤为重要。

水稻是中国乃至亚洲的主要粮食作物之一，世界上有90%的水稻产于亚洲。我国是水稻生产消费大国，大约有65%的人是以水稻为主食[9]，南方Sb矿周边种植大量的水稻，对水稻生长造成一定的污染，湖南省Sb矿山附近的水稻土中检测到Sb的含量是1565 mg·kg-1[10]，是WHO推荐的土壤Sb污染最大允许浓度36 mg·kg-1的43倍，水稻植株的根和种子积累分别高达225 mg·kg-1和5.79 mg·kg-1[11]。根伸长抑制率是评价重金属生态毒性的一个重要指标[12-13]。本研究选取全国各地、各种类型的水稻作为研究对象，研究不同品种水稻对Sb胁迫的响应差异，以根伸长半抑制最大效应浓度（Concentration for 50%of maximal effect，EC50）作为主要参考，对比水稻根部Sb的吸收，及SOD酶和MDA等生理生化指标，比较不同品种水稻对Sb的敏感性，初步探究Sb致毒机理，为污染地区种植水稻品种的选择提供依据；同时为开展Sb毒性阈值和生态毒性研究及我国Sb标准的建立提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）水稻品种：供试水稻品种共44种，包括连糯一号、浙优18、鄂丰28、南粳5055、II优7954远杂绿稻Q7、徐旱1号、淮粳5号、紫香米、南粳9108、武育糯16号、绿旱、6两优 9368、旱稻 998、川香优 2号、钱优0506、冈优177、镇籼优184、钱优1号、春优84、徽两优898、川优6203、黑稻、钱优0508、龙庆稻1号、超级旱稻502、龙稻20、冈优7954、富禾66、旱稻65、深两优5183、苏育糯、黑糯米、荆两优1198、II优1259、郑旱6号、扬粳687、绿糯米、中优188、东农425、镇糯19号、盐粳6号、Ⅱ优98、屉优267

（2）供试试剂：酒石酸锑钾，KSbC4H4O7·1/2H2O，AR，上海试四赫维化工有限公司；焦锑酸钾，K2H2Sb2O7·4H2O，AR，上海试四赫维化工有限公司；实验过程中所使用的试剂均为分析纯；去离子水。

（3）供试仪器：多功能环境培养箱（MLR-351H，三洋，日本）；原子荧光光度计（AFS-230E，北京海光仪器公司）；莱伯泰科微控数显电热板（EG35A Plus，浙江纳德科学仪器有限公司）；高速离心机（TG16-WS，湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 72 h根伸长毒性测试

选取饱满的水稻种子，洗净，经消毒、泡种、催芽之后，挑选根长一致的幼芽移植到500 mL装有营养液的PVC罐中，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）处理下的各种不同浓度均设置3个平行，每个平行中有6株幼芽，营养液是1/4强度IRRI营养液[14]，Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）的暴露浓度分别为：0.00、0.31、0.61、3.07、6.14、30.69、61.38、92.07 mg·L-1和 0.00、0.51、2.54、5.08、25.38、50.78、76.17、101.55 mg·L-1等8个浓度梯度。通过HNO3和NaOH调节营养液pH到5.5。将装有营养液和幼芽的PVC罐置于32℃培养箱中培养72 h。72 h之后拍下幼芽的照片，以Image J处理图片测得水稻根伸长，记录并计算根伸长的平均值、相对根伸长（Relative root elongation，RRE）。RRE计算公式为：

式中：RLT是指不同浓度Sb（Ⅲ）或Sb（Ⅴ）处理下样品的根长，RLC是RLT对应处理下的对照组根长；RLS代表初始根长。

EC50常指半数最大效应浓度，在本实验中表示相对根伸长RRE为50%时暴露液的浓度，EC50是定量反应Sb对水稻的胁迫能力大小的一个指标，EC50越大说明Sb的毒性越小，反之Sb的毒性越大。EC50可以根据Haanstra等定义的对数模型计算，对数模型公式如下[15]：

式中：RRE为记录的相对根伸长或者Sb浓度通过拟合得到的相对根伸长，ɑ是表示抑制比率参数，b是相对根伸长为50%时暴露液Sb浓度的对数，x是Sb浓度的自然对数。

1.2.2 水稻根中Sb总浓度的测定

毒性暴露试验结束后，收集水稻根，用去离子水漂洗3～4次后，所有的根都放进烘箱中，90℃杀青1 h，70℃烘干至恒质量。称质量后置于50 mL锥形瓶中，加入适量的硝酸并放上小漏斗，放置在通风橱中冷消解一夜。次日，进行消解，定容，用原子荧光光度计（AFS）测定[16]。Sb的检测限是20 μg·L-1。标准样品（GBW10015菠菜）用于质量控制，其回收率为126.67%。同时做试剂空白。

Cmax可根据Michaelis-Menten方程计算[17]，方程如下：

式中：C是水稻根中Sb的浓度，Cmax是水稻根吸收Sb的最大浓度，Kmax是最大吸收常数，x是培养液中Sb的浓度。

1.2.3 酶指标测定

经2.2.1和2.2.2实验筛选出的紫香米、扬粳687、深两优5183和徐旱1号作为试验水稻，经过消毒和催芽处理后，开展根伸长抑制试验，Sb的暴露浓度为6.09 mg·L-1。以1/4 IRRI来配制培养液，选择根长一致的幼芽，培养72 h后将根剪下并称鲜重，然后用破碎机进行破碎组织，离心，显色，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，用WST-1法测定SOD活力，用酶标仪比色法测定MDA含量[18]。

1.2.4 数据处理

根长通过ImageJ（国立健康研究所，美国）处理；根伸长计算用Excel处理；EC50半数最大效应浓度曲线和最大吸收曲线通过OriginPro 8.5拟合。采用单因素并结合多重比较法（Tukey检验）比较各品种之间的显著性（P＜0.05）。本实验所有数据均为3次重复，数据统计分析采用SPSS 20.0软件，采用OriginPro 8.5画图。

2 结果与讨论

2.1 不同形态的Sb对水稻根伸长的胁迫

不同形态的Sb均能抑制水稻根系的生长，且相较于Sb（Ⅴ），Sb（Ⅲ）对水稻根系形态各指标的影响比较大[19]。Sb、As为同族元素，两者之间的性质有很多相似之处，有研究表明水稻不同品种耐As性存在差异[20]，本研究表明不同品种水稻对Sb的耐性也存在差异。不同品种水稻的EC50结果如图1、图2，由此可见Sb（Ⅲ）的毒性比Sb（Ⅴ）的毒性大，且不同基因型水稻对Sb的敏感性存在显著差异（P＜0.05）（数据未列出）。如图 1 所示，扬粳 687 的 EC50，Sb（Ⅲ）值最小为0.82 mg·L-1，表明扬粳687是对Sb（Ⅲ）的敏感品种；徐旱 1号的EC50，Sb（Ⅲ）值最大为 100.24 mg·L-1，表明徐旱1号是Sb（Ⅲ）的耐性品种，徐旱1号的EC50，Sb（Ⅲ）是扬粳687的122倍。如图2所示，EC50，Sb（Ⅴ）最小的是深两优5183值为13.34 mg·L-1，表明深两优5183是Sb（Ⅴ）的敏感品种；EC50，Sb（Ⅴ）最大的是紫香米值为 776.78 mg·L-1，表明紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品种，紫香米的EC50，Sb（Ⅴ）是深两优5183 的58倍。

图1 Sb（Ⅲ）对不同品种水稻EC50的影响Figure 1 Effect of Sb（Ⅲ）on EC50of different rice

2.2 不同品种水稻根对Sb的吸收

根系是植物吸收矿物质营养和水分的主要器官，植物能够通过减少根部与重金属的接触面积，从而降低对重金属的吸收[19]。根对重金属的吸收量在一定程度上影响整株植物对重金属的吸收量。不同形态的Sb进入水稻的方式不同，且水稻对Sb的吸收速率也不一样[11]。

不同品种水稻对Sb的吸收最大值也有显著差异（P＜0.05）（数据未列出），结果如图3和图4所示。由图3可见，不同品种的水稻对Sb（Ⅲ）的吸收最大值在5～12 mg·kg-1之间，敏感品种扬粳687的最大吸收值为8.43 mg·kg-1，耐性品种徐旱1号的最大吸收值为6.09 mg·kg-1。由图4可见，水稻对Sb（Ⅴ）的最大吸收值在0.5～11.5 mg·kg-1之间，敏感品种深两优5183的最大吸收值为1.69 mg·kg-1，耐性品种紫香米的最大吸收值为2.06 mg·kg-1。本研究结果验证了Sb（Ⅲ）处理下的水稻根吸收Sb含量高于Sb（Ⅴ）处理的结论。

2.3 Sb的致毒机理

2.3.1 相对根伸长

重金属对植物的发芽率、根伸长及一些根部的形态变化有一定的影响，其中根伸长的变化是植物对重金属胁迫最直观的指标之一。由图5A可见，水稻在Sb（Ⅲ）处理下的相对根伸长小于Sb（Ⅴ）处理组，扬粳687、深两优5183和紫香米在不同的Sb处理下存在显著差异（P＜0.05），徐旱1号在不同的Sb处理下没有显著的差异（P＞0.05）。对照组、Sb（Ⅲ）处理组和Sb（Ⅴ）处理组徐旱1号的根伸长抑制率分别为：0、21.92%和22.86%，紫香米的根伸长抑制率分别为：0、46.75%、35.40%。

图2 Sb（Ⅴ）对不同品种水稻EC50的影响Figure 2 Effect of Sb（Ⅴ）on EC50of different rice

图3 Sb（Ⅲ）培养下不同品种水稻对Sb的最大吸收量Figure 3 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅲ）culture

2.3.2 Sb的吸收量差异

植物体内过量的Sb会影响植物的生长，5～10 mg·kg-1Sb在植物组织中会损伤植物的生长[21]。本研究结果显示如图5B，6.09 mg·L-1Sb处理组，水稻的根部Sb含量均小于5 mg·kg-1，表明在该浓度下植物的生长受到的损伤不严重。不同Sb处理的水稻根部对Sb吸收存在着显著差异，有研究表明Sb（Ⅲ）处理组的一些植物根吸收Sb浓度大约是Sb（Ⅴ）处理组的3倍[22]。本研究的结果显示，在Sb（Ⅲ）处理下这四种水稻根的Sb含量是Sb（Ⅴ）处理组的5倍。两个结果之间存在偏差可能的原因有两个：一是实验所使用的植物不同，二是实验所用的时间不同。

2.3.3 水稻根在Sb胁迫下超氧化物歧化酶的差异

SOD（超氧化物歧化酶）是生物体内普遍存在的酶之一，在ROS防御机制中起着关键的作用，它能够降低膜脂过氧化作用，维持细胞膜的稳定性[23]。抗氧化和解毒是环境胁迫的第一道防线[24]，但增加污染物浓度可能导致这些过程的崩溃和其他相关反应的刺激[25]，SOD活力的降低表明对细胞的毒性超过细胞的极限，造成了SOD的消耗或者造成SOD瞬间保护不足[26]。研究表明外源As处理下，小于20 mg·kg-1时As浓度增加时植物体内SOD增加，说明SOD在低As条件下在保护植物方面起着重要的作用；外源As大于20 mg·kg-1时，As增加时植物体内的SOD呈减少趋势，是植物中毒现象[27]。Chai等研究发现Sb的存在降低了苎麻（Boehmeriɑ niveɑ）中SOD含量，但存在明显的浓度效应，40 mg·L-1的Sb显著降低了SOD酶活性，但随着浓度的进一步增加，SOD酶活性又显著增加[28]。我们的研究发现 6.09 mg·L-1的 Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）处理均显著增加了水稻根中SOD酶活性，与Sb（Ⅲ）相比，Sb（Ⅴ）处理增加更为显著（图6A）。

图4 Sb（Ⅴ）培养下不同品种水稻对Sb的最大吸收量Figure 4 The maximum absorption of Sb by different varieties of rice under Sb（Ⅴ）culture

图5 不同处理下水稻相对根伸长（A）和Sb总量（B）的比较Figure 5 The relative root elongation（A）and the concentration of rice（B）with different Sb treatments

2.3.4 水稻根在Sb胁迫下丙二醛的差异

丙二醛（MDA）是过量的活性氧指数和细胞膜脂质过氧化作用产物，可作为应激化条件下脂质过氧化状态的指标[23]。MDA含量的增加通常表现为保护机制，消耗丙二醛对植物器官有轻微的损害[26]。As浓度的增加导致水稻根茎中MDA的增加是由于As引起的氧化压力[27]，Sb污染使ROS诱导脂质过氧化，导致MDA的含量增加。研究结果表明（图6B），水稻根部受到Sb的胁迫之后MDA的含量均比对照组大；且相比于Sb（Ⅴ）处理组，Sb（Ⅲ）处理组的水稻根MDA含量较大，表明水稻幼苗的生长过程中受到Sb（Ⅲ）引起的氧化压力大于Sb（Ⅴ）引起的氧化压力，说明该Sb（Ⅲ）对水稻根部的伤害更严重。

3 结论

根伸长的变化是植物对重金属胁迫最直观的指标之一，论文以EC50作为水稻耐Sb能力大小的筛选指标研究了Sb对水稻的生物毒性，发现Sb（Ⅲ）对水稻根伸长的毒性显著大于Sb（Ⅴ），试验的44种水稻品种中，扬粳687是Sb（Ⅲ）的敏感品种，徐旱1号是Sb（Ⅲ）的耐性品种；深两优5183是Sb（Ⅴ）的敏感品种，紫香米是Sb（Ⅴ）的耐性品种。水稻对不同形态Sb的吸收差异较大，水稻对Sb的吸收量与水稻对Sb的敏感性之间没有显著的相关性，但是水稻对Sb（Ⅲ）的吸收显著高于Sb（Ⅴ）。Sb显著影响了水稻根中SOD酶活性和MDA含量，6.09 mg·L-1的Sb处理增加了水稻根中SOD酶活性，且Sb（Ⅴ）处理显著高于Sb（Ⅲ）；Sb暴露显著增加了水稻根中MDA含量，且Sb（Ⅲ）处理显著高于Sb（Ⅴ），表明Sb（Ⅲ）的毒性要高于Sb（Ⅴ）。

图6 不同Sb处理下水稻的SOD活力（A）和MDA含量（B）Figure 6 The activity of SOD（A）and the concentration of MDA（B）with different Sb treatments