索拉非尼联合小剂量阿糖胞苷治疗急性髓细胞白血病疗效及对患者干细胞NF-κB及FLT3蛋白表达影响

于 婷， 郑 立,袁 颖

四川省广元市中心医院血液内科(广元 628000)

主题词 白血病, 髓样, 急性/治疗 @索拉非尼 阿糖胞苷 @蛋白表达

急性髓细胞白血病 (Acute myeloid leukemia,AML)是髓系造血干细胞的克隆增殖导致的造血功能受损继而出现白血病细胞器官浸润、粒细胞缺乏等恶性血液肿瘤。AML在35岁以上成人中发病率最高[1]，病死率占癌症死亡的1.6%[2],随着肿瘤靶向治疗技术的不断提高，抑制AML异常突变基因治疗研究逐渐增多，FLT3基因突变是AML最常见的基因突变，FLT3基因突变的阳性表达常预示预后不良[3]，NF-κB是一类参与炎症、免疫、应激、肿瘤发生发展等生物学行为中基因调节的重要转录因子，在细胞信号通路中起关键作用。索拉非尼是首个口服多靶点激酶抑制剂, 具有多靶点控制、广谱、易于联合用药，患者耐受性好等优点[4]，联合化疗在治疗难治性和移植后复发的AML有较大的优势[5]。目前关于索拉菲尼联合化疗对FLT3、NF-κB表达的研究较少，此背景下，对我科62例AML患者采用索拉菲尼联合小剂量Ara-C治疗，观察临床疗效以及对FLT3、NF-κB表达的影响，报道如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2016年1月至2017年2月我院血液科收治的62例经AML患者。复发难治性AML诊断依据参考中华医学会血液学分会修订的AML中国诊疗指南(2011年版)。AML患者形态学分型参考FAB分型。所有患者均经我院细胞遗传学、骨髓形态学、分子生物学(MICM)、免疫学等检测[6]确诊。采用随机数字表法将患者随机分为两组，每组31例，研究组男16例，女15例，年龄(36.82±6.97)岁，BMI(23.58±4.25)Kg/m2，FAB分型：M1型7例，M2型15例， M4型4例，M5型5例，初诊16例，复发15例；对照组男18例，女13例，年龄(37.26±7.05)岁，BMI(24.97±4.08)Kg/m2，FAB分型：M1型6例，M2型13例， M4型6例，M5型6例，初诊14例，复发17例；两组基线有可比性(P>0.05)。

2 方 法

2.1 治疗方法：研究组患者于进食前1 h或进食后2 h口服索拉非尼片(德国拜耳)400 mg，2次/d，连续服用35 d，治疗过程中患者若出现不耐受可降低服用次数至1次/d或隔日一次;阿糖胞苷注射液(国药准字H20055128)50 mg皮下注射,治疗14 d。对照组采用DA诱导化疗方案：柔红霉素(20 mg/支，国药准字H33020925)60 mg溶于250 ml的0.9%NaCl溶液中快速静点，1次/d,连续用药3 d，Ara-C200 mg溶于500 ml 5%GS溶液中缓慢静滴，连续用药7 d。

2.2 副作用观察及支持治疗：每日5%NaHCO2250 ml静脉滴注碱化尿液,阿扎司琼注射液2 ml化疗前后静脉注射预防呕吐，强水化治疗(每日静脉液体入量2500～3000 ml/m2)。中性粒细胞缺乏(ANC<0.5×109/L[7])时入住层流病室，每日皮下注射粒细胞集落刺激因子150～300 μg,无菌饮食，并加强口腔、鼻腔、外耳道、皮肤护理和肛周护理及中心静脉置管护理。每3 d检查一次血常规，如Hb<60 g/L，给予输注红细胞悬液，若Plt<20×109/L 时，给予输注单采血小板悬液。当出现中性粒细胞缺乏或发热时，给予抗感染治疗，参照2012年中国中性粒细胞缺乏伴发热患者抗菌药物临床应用指南[8]，抗真菌治疗参考 2013 年血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则[9]。

2.3 NF-κB检测方法：所有患者均于治疗前后采集骨髓5 ml，置入抗凝试管，PBS液洗涤，应用免疫磁珠分选系统和流式细胞仪进行白血病干细胞的分选和纯化。于细胞培养箱中培养骨髓单个核细胞48 h，Western Bloting法检测NK-κB的表达。

2.4 FLT3基因检测方法：采用多聚酶链反应PCR+单链构象多态性SSCP方法患者治疗前、后新鲜骨髓中的FLT3基因及FLT3-ITD基因突变。所有患者均于治疗前、后采集骨髓5 ml，置入抗凝试管，PBS液洗涤，应用免疫磁珠分选系统和流式细胞仪进行白血病干细胞的分选和纯化。于细胞培养箱中培养骨髓单个核细胞48 h。总DNA使用全血基因组提取试剂盒进行提取，并测定A260/A280，判断DNA的浓度和纯度。采用去离子水稀释终样品至500 ng/μl，备用。根据FLT3突变区的一般情况，将检测上游引物、下游引物及扩增产物长度分别设计为5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’、5’-CTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’及329bp。采用PCR试剂盒，20 pmol/μl上下游引物+500 ng基因组DNA，去离子水定容至50 μl。经过30个循环的预变性、变性、退火、延伸过程，取15 μl反应产物，运用琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。

3 观察指标 疗效评价：治疗结束2周进行骨髓穿刺复查骨髓细胞形态，参照血液病学诊断及疗效标准[10]，CR：未发现白血病细胞浸润所致的症状和体征;Hb≥100 g/L(男)或Hb≥90 g/L(女及儿童)，ANC≥1.5×109g/L，血小板≥100×109g/L，外周血未发现白血病细胞；原粒细胞Ⅰ型 +Ⅱ型、原始细胞+幼稚单核细胞或原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞≤5%，红细胞及巨核细胞系正常。PR:5%<骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始单核+幼稚单核细胞或原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞)≤20%，临床、外周血象中有一项未达完全缓解者。NR：骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始单核+幼稚单核细胞或原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞)>20%，临床症状未改善，外周血仍存在白血病细胞。安全性评价指标：依据WHO急性及亚急性化疗药物毒性分级标准判定不良反应，0(无)、Ⅰ(轻度)、Ⅱ(中度)、Ⅲ(重度)、Ⅳ(威胁患者生命)。

结 果

1 疗效评价 研究组22例CR，7例PR，2例未缓解，对照组16例CR，9例PR，6例未缓解。两组PR例数差异无统计学意义(P>0.05)；研究组CR比例高于对照组，差异具有统计学差异(P<0.05)；研究组NR比例低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2 安全性评价 研究组2例中性粒细胞缺乏，1例血小板减少、1例贫血、1例消化道不良反应、2例感染，均为Ⅰ-Ⅱ级不良反应，不良反应率22.58%，显著低于对照组(P<0.05)，且研究组粒缺时间(12.94±2.17)d，显著低于对照组(P<0.05)，见表2。

3 FLT3、NK-κB在不同治疗组治疗前后的差异 两组FLT3、NK-κB在治疗前表达无差异(P>0.05)，研究组治疗后FLT3、NK-κB的表达均出现下调(P<0.05)，表达强度低于对照组(P<0.05)，见表3。

表1 两组疗效评价[例(%)]

表2 两组安全性评价

表3 不同治疗组治疗前后FLT3、NK-κB表达的差异

讨 论

FLT3是对造血免疫系统具有重要意义的受体络氨酸激酶，在正常造血系统表达于早期造血祖细胞、树突细胞和大脑、胎盘等组织，过度表达于AML的各个FAB分型，以及B细胞ALL和部分T细胞ALL。35%AML患者存在FLT3基因突变，FLT3+患者对常规化疗不敏感，疗效差，诱导化疗缓解率低、缓解维持时间短、极易复发，部分接受异体造血干细胞移植后仍可出现复发，FLT3基因突变常提示预后不良。

索菲拉尼是一种小分子、多靶点多激酶抑制剂，对存在细胞内和表面的Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3等可显著抑制，阻断肿瘤新生血管的形成间接抑制肿瘤，同时索菲拉尼还可以通过抑制RAF等信号通路直接抑制肿瘤生长。索菲拉尼最初用于肾癌、肝癌的治疗。本研究组患者采用索菲拉尼联合小剂量阿糖胞苷治疗AML初治和复发患者完全缓解22例，CR率70.97%，且在诱导化疗期间不良反应少，虽然中性粒细胞缺乏发生率较高，但是明显低于对照组，且中性粒细胞缺乏时间明显短于对照组，其它不良反应均为骨髓抑制和消化道副作用，且不良反应分级均为Ⅰ-Ⅱ级，不良反应率22.58%，总体低于对照组。可能与研究组方案减少了阿糖胞苷使用剂量从而降低骨髓抑制程度有关。索菲拉尼联合小剂量阿糖胞苷不仅可以提高临床缓解率，而且可以降低不良反应，提高患者治疗耐受度，增强治疗效果。其次我们研究了不同治疗方案对AML患者FLT-3以及NK-κB表达的影响，可以看出两组治疗后FLT-3、NK-κB表达均出现下调，证明两种化疗方案均对FLT-3、NK-κB表达都可产生一定的影响，但索菲拉尼联合小剂量阿糖胞苷对FLT-3、NK-κB表达的影响程度更大，研究组方案对FLT-3基因突变AML患者治疗效果优于对照组，同时也提示我们索菲拉尼可能通过抑制FLT-3基因表达抑制白血病细胞生长增殖的机制。综上，联合索菲拉尼和小剂量阿糖胞苷治疗可明显降低FLT3基因的表达，提高AML临床缓解率高，且对复发AML患者有效。