脐带间充质干细胞治疗心脏扩大伴心力衰竭类心肌病病儿的效果

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(青岛大学附属妇女儿童医院，青岛市妇女儿童医院,山东 青岛 266034 1 心脏中心； 2 儿童超声科； 3 重症医学中心)

扩张型心肌病(DCM)是一种以单心室/双心室球形扩大，并且伴有进行性心脏收缩功能减退的疾病[1]。小儿心肌病年发病率为(1.24～1.31)/10万，而DCM占其中一半以上，是引起儿童心力衰竭(简称心力衰竭)的重要原因之一[2]。约40% DCM病儿后期合并心力衰竭，最终不得不接受心脏移植，或者在诊断后的2年内面临死亡[3]。目前该病主要的治疗方法包括药物治疗、心脏起搏器置入以及心室减容成形术等[4]，但都不能从根本上解决心肌细胞再生及心肌功能重建等问题[5]。脐带间充质细胞(UC-MSCs)的治疗为DCM伴有心力衰竭的病儿提供了一种崭新的及有益的尝试[6]。人UC-MSCs(hUC-MSCs)是成体干细胞的一种，具有较高自我更新能力[7]，其来源丰富，具有多向分化潜能及移植后不良反应少等优点[8]，是移植的“种子细胞”的理想来源。本研究通过对心肌病伴心力衰竭病儿接受hUC-MSCs治疗前后临床、相关检查及实验室指标的观察，评估hUC-MSCs对心肌病伴心力衰竭病儿的临床治疗效果，旨在为干细胞的治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

纳入标准：①确诊心脏扩大伴有心力衰竭的心肌病，如DCM、心室肌致密化不全、心内膜弹力纤维增生症；②NYHA分级为Ⅱ～Ⅳ级或者具有等同于Ⅱ～Ⅳ级的症状；③左心室射血分数>20%；④已给予至少1次大剂量丙种球蛋白治疗，效果不佳；⑤治疗年龄为1月龄～18周岁；⑥病儿和(或)病儿家属签署知情同意书。排除标准：①具有持续性室性心动过速或颤动病史者；②植入心脏除颤器者；③潜在的心脏除颤器候选者；④其他：有晕厥病史、5年内患有肿瘤、活动性感染性疾病以及病毒性疾病实验阳性者等。本研究在clinicaltrails.gov网站注册编号为NT01219452，已报经医院伦理委员会批准。

符合入选条件的病儿共17例，男9例，女8例。其中诊断为DCM者4例，心肌致密化不全者12例，心内膜弹力纤维增生症者1例。NYHA心功能分级Ⅱ级者10例，Ⅲ级者5例，Ⅳ级者2例。初诊年龄为1～144个月，平均为(44.23±48.32)个月；hUC-MSCs治疗前的病程为3～120个月，平均为(29.29±27.03)个月。细胞治疗前存在端坐呼吸者5例，口唇发绀者2例；心脏听诊闻及奔马律者4例，肝脏肿大者4例，双下肢水肿者2例。细胞治疗前心电图存在多导联ST-T改变者17例，其中期前收缩(房性或室性)者4例，传导阻滞者4例。17例病儿均常规给予强心、利尿和扩血管药物治疗，所用药物为地高辛、双氢克尿噻或呋塞米、安体舒通、卡托普利或苯那普利；细胞治疗前，15例(88.2%)心肌病病儿给予β受体阻断剂(美托洛尔或卡维地洛)治疗，其疗程为1～120个月，平均(23.7±13.2)个月。17例病儿均给予丙种球蛋白治疗1～4次，其总剂量为2～6 g/kg；10例(58.8%)病儿给予激素治疗，其疗程为12～48个月，平均(25.9±12.2)个月。所有病儿细胞治疗前常规给予左卡尼丁口服液、维生素B1、维生素B2及辅酶Q10等治疗。

1.2 hUC-MSCs来源

hUC-MSCs由青岛奥克生物开发公司生产并提供，1 U hUC-MSCs含有1×107个细胞，流式细胞仪检测细胞表型为CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)，符合间充质干细胞表型特征；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、支原体、巨细胞病毒和HIV检测均阴性；需氧菌培养和真菌培养阴性。

1.3 方法

hUC-MSCs的应用方法为肌肉注射，选取双上肢三角肌和双下肢股四头肌各1处为注射点；根据病儿年龄不同，每次肌肉注射剂量为0.5～1.0 U，每个月应用1次，连续给予2～3次。细胞治疗期间病儿继续应用抗心力衰竭等基础治疗药物，所用药物有地高辛、双氢克尿噻或呋塞米、安体舒通、卡托普利或苯那普利、左卡尼丁口服液、维生素B1、维生素B2及辅酶Q10等。

1.4 观察指标

细胞治疗后观察以下指标。①临床指标为临床症状，无症状生存时间、存活和死亡人数及存活者心功能。存活者心功能评价标准：NYHA提高2级及以上为明显好转，NYHA提高1级及以上为好转，NYHA无提高或恶化为无好转。②心脏超声指标为左心室射血分数、左心室短轴缩短率、左心室舒张末期内径和左心室收缩末期内径。③实验室指标为氨基未端脑钠肽前体(NT-proBNP)。

1.5 安全性观察指标

观察病儿细胞治疗后有无体温波动、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、感染等；注射局部有无肿胀、钙化、新生肿物及感染；心电图或动态心电图观察有无新的心律失常发生；实验室检测血常规(白细胞、血红蛋白、血小板)、尿常规(尿红细胞、尿白细胞、尿蛋白)和肝肾功能改变(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐)。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 病儿治疗后NYHA心功能的变化

细胞治疗后，病儿明显好转者4例(23.5%)，好转者11例(64.7%)，无好转者2例(11.8%)，病儿总体心功能改善(u=-3.637，P<0.05)。NYHA分级由Ⅳ级转为Ⅱ、Ⅲ级者各1例；Ⅲ级转为Ⅰ级者3例，转为Ⅱ级者2例；Ⅱ级转为Ⅰ级者8例； Ⅱ级无改善者和转为Ⅲ级者各1例，此2例病儿均存在难以控制的反复呼吸道感染。

2.2 病儿治疗后生存质量情况

至本次随访结束，总随访时间为7～74个月，平均随访时间为(31.5±30.27)个月，最长随访时间为74个月。17例心肌病病儿于细胞治疗后均存活，目前均口服抗心力衰竭基础药物；其中13例病儿临床无任何心力衰竭症状，参加同年龄组儿童的日常活动，如上学或进幼儿园，其生存时间为3～28个月，平均生存时间为(13.8±10)个月；4例病儿仍存在心力衰竭症状，其中轻度端坐呼吸者1例，肝脏肿大者2例，双下肢水肿者1例，日常活动轻度受限，不能参加同年龄组儿童的日常活动，其生存时间分别为7、13、32以及74个月，平均生存时间为(31.5±33.5)个月。

2.3 病儿治疗前后外周血NT-proBNP水平及心脏超声的变化

hUC-MSCs治疗后14例病儿NT-proBNP水平由治疗前(697±693)ng/L下降至治疗后(200±141)ng/L，治疗前后比较，差异有显著性(t=2.641，P<0.05)。3例病儿因反复呼吸道和(或)消化道感染，心功能无明显好转，NT-proBNP多次复查处于较高水平，其中1例细胞治疗后较治疗前明显升高，心功能分级恶化；1例病儿细胞治疗前后无明显变化，心功能分级无改善；1例病儿细胞治疗后较治疗前明显下降，但仍处于较高水平，心功能分级好转。

hUC-MSCs治疗后病儿左心室射血分数由治疗前(37.2±10.9)%提高到(45.4±13.0)%，治疗前后比较，差异具有显著意义(t=-2.910，P<0.05)，其中12例病儿治疗后的左心室射血分数由治疗前(35.6±9.8)%提高到(49.6±12.2)%，差异有显著性(t=-6.196，P<0.05)；5例病儿的左心室射血分数治疗后无升高，其中3例较治疗前无变化，但其心功能分级有所好转；2例较治疗前下降，心功能分级恶化或无改善。

hUC-MSCs治疗后病儿左心室短轴缩短率由治疗前(19.4±6.2)%升高至(22.6±7.3)%，但治疗前后比较，差异无显著性(P>0.05)；其中11例病儿由治疗前(18.0±5.0)%升高至(24.8±7.2)%，治疗前后比较，差异有显著性(t=-5.648，P<0.05)；6例病儿较细胞治疗前无升高，其中2例较治疗前下降，心功能分级恶化或无改善；2例稍有下降；2例无变化，但其心功能分级有所好转。

hUC-MSCs治疗后病儿左心室舒张末期内径由治疗前(51.2±10.4)mm缩小至(48.1±11.8)mm，治疗前后比较，差异具有显著意义(t=2.591，P<0.05)；其中11例由治疗前(49.7±10.4)mm缩小至(44.4±10.8)mm，治疗前后比较，差异具有显著性(t=3.689，P<0.05)；6例较治疗前无缩小，其中2例较治疗前增大，心功能分级恶化或无改善；4例无明显变化，但其心功能分级有所好转。

细胞治疗后病儿左心室收缩末期内径由治疗前(41.3±12.0)mm缩小至(37.1±13.0)mm，治疗前后比较，差异具有显著性(t=2.805,P<0.05)；其中13例病儿治疗后由治疗前(43.9±12.4)mm缩小至(37.8±14.6)mm，治疗前后比较，差异具有显著性(t=3.718,P<0.05)；4例病儿较治疗前无缩小，其中2例较治疗前增大，心功能分级恶化或无改善；2例无变化,但其心功能分级有所好转。

2.4 安全性

17例心肌病病儿细胞治疗后的1周内，尤其是48 h之内出现面颊和口唇红润，部分病儿出现多汗，无发热、皮疹、恶心、呕吐、腹泻等。肌肉注射部位未见红肿、出血、发硬及肿胀等异常。1例6岁病儿细胞治疗后右侧腹股沟斜疝自愈。细胞治疗后病儿心电图明显改善，表现为ST-T压低改善，2例室性期前收缩及2例房性期前收缩病儿期前收缩次数明显减少，传导阻滞消失；未合并感染的病儿无新发心律失常出现；仅1例病儿因合并重症感染出现阵发性室上性心动过速、频发室性期前收缩，经抗感染、抗心律失常治疗后心律失常消失，目前心电图仅见多导联ST-T段改变。细胞治疗前后外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮及肌酐均未见明显升高或者降低(P>0.05)。见表1。细胞治疗前1例合并感染病儿白细胞计数偏高，1例合并急性心力衰竭和感染的病儿存在肝肾功能损害，表现为谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐值增高，余15例病儿上述指标均在正常范围；细胞治疗后2个月及随访结束时上述指标均在正常范围。细胞治疗前后监测尿蛋白、尿白细胞和尿潜血均为阴性。

3 讨 论

近年来，有关干细胞临床治疗的研究越来越多，而且逐渐倾向于有关间充质干细胞应用研究[9-10]。UC-MSCs是间充质干细胞的一种，其来源于包绕脐带血管的结缔组织——华尔通胶(WJ)[11]，具有以下优点：具有干细胞的多项分化潜能[7]；取材方便，来源丰富，伦理争议少；低免疫原性，移植相关排斥反应小，安全性高[12]。这些优点使其成为临床应用治疗多种系统疾病的很好的选择[9]。目前多项研究表明，UC-MSCs在心脏修复及心脏疾病治疗中具有较高的安全性及有效性，是移植的“种子细胞”的理想来源[13-14]。

既往我们已经对hUC-MSCs治疗DCM进行了相关的实验研究，研究对象为正常大鼠及DCM大鼠，发现肌肉注射hUC-MSCs对正常大鼠无影响，主要表现为注射前后心脏结构、功能以及心肌相关细胞因子的水平无明显变化[15-16]，大鼠内脏各器官(肺、肝、脾、脑、肾、肌肉)结构无异常，大鼠血常规、血生化及尿常规亦无明显变化，大鼠生活习性以及生长发育无明显的变化[17]；肌肉注射hUC-MSCs对DCM大鼠有一定的影响，表现为增加心肌组织胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子等细胞因子的表达，促进心肌微血管再生，减轻心肌组织病理损伤，改善心肌组织超微结构，从而使心功能改善，并具有一定的免疫调节功能[18-20]。以上动物实验研究为hUC-MSCs的临床应用提供了有效性及安全性证据。

表1 病儿治疗前后血常规和肝肾功能指标比较

目前UC-MSCs治疗心肌病的相关临床研究报道较少,FISHER等[21]将干细胞应用于慢性缺血性心脏病的治疗，ISHIGAMI等[22]发现冠状动脉内注射干细胞治疗单心室改变的心脏病，可以改善心脏功能，PINCOTT等[23]报道了骨髓来源的干细胞应用于成人DCM的治疗；FANG等[24]将hUC-MSCs应用于缺血性心脏病患者治疗效果的研究。这些研究均显示干细胞可应用于心脏疾病的治疗，可部分改善部分病人的心功能。目前相关的研究认为，hUC-MSCs治疗心肌病的可能机制如下：①替代作用，hUC-MSCs诱导后分化为心肌细胞，移植至体内替代病变心肌[25]；②自分泌或旁分泌功能，分泌血管生成因子、生长因子、细胞因子等物质，从而改善心肌功能[26]；③抗低氧诱导心肌凋亡功能[27]；④免疫调节功能[28]；⑤促进血管再生功能；⑥激活内源性心脏干细胞，从而促进心肌修复[29]。

本研究结果显示，肌注hUC-MSCs可改善部分心肌病伴心力衰竭病儿的临床症状及心功能，表现为活动耐力提高，可实现无症状生存，左心室射血分数提高，左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径减小；肌注hUC-MSCs后无明显不良反应，安全性较好，肌注部位无明显异常，且未发现hUC-MSCs移植相关的血常规异常、肝肾功能损害、恶性心律失常等。但本研究样本较少，随访时间较短，尚需要多中心、大样本、前瞻性的病例对照研究进一步明确其有效性和安全性。