沉默Blimp-1促进IFN-γ表达抑制肝癌细胞的作用研究

邓 浩，彭启旺，李 伟

(武汉市红十字会医院普通外科，武汉 430021)

肝癌是严重威胁人类健康的常见肿瘤，发病率逐年上升[1-3]。肝癌具有初期症状不明显、潜伏期长的特点，多数患者确诊时已是晚期，病情发展迅速，而且预后较差。目前，肝癌的主要治疗方式是手术、肝移植、化疗、分子靶向治疗等，但治疗效果均不理想，预后复发和转移是导致患者死亡率居高不下的主要原因。近年来，通过免疫治疗的方式逐渐应用于临床，其可通过刺激机体免疫系统靶向识别并特异性杀伤肝癌细胞，但对机体自身成分不具有危害性，而且可以产生免疫记忆细胞，防止复发，因此免疫治疗成为肝癌临床治疗的研究热点和重点[4-5]。B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B-lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)，又称为PR结构域蛋白1(positive regulatory domain zinc finger protein 1，PRDM1)，在B细胞分化过程中发挥关键作用，其表达量增加可促进细胞产生大量免疫因子，从而调控机体的免疫状态[6-7]。近年来的研究表明，Blimp-1在肿瘤组织的表达量异常，参与肿瘤的发生、发展过程[8-9]。因此本实验通过研究Blimp-1在肝癌细胞中的作用以及作用机制，为肝癌的临床治疗提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

肝癌SMMC-7721细胞系由本实验室传代、保存，最初购自中科院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；实时荧光定量PCR(RT-PCR)试剂盒购自瑞士Roche公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒、膜联蛋白V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；Blimp-1单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司；γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒购自上海森雄生物有限公司；shRNA-NC、shRNA-Blimp1、空载体慢病毒由上海吉玛生物公司合成。酶标仪购自美国赛默飞世尔公司；荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养和转染

肝癌SMMC-7721细胞置于37℃、5% CO2细胞培养箱，加入RPMI 1640培养基(含1%双抗和10%胎牛血清)，倒置显微镜中观察细胞生长状况，隔天更换一次培养基，对数期细胞用于后续实验。细胞转染前一天，更换培养液，以每孔4 × 105个细胞接种于96孔板中。将细胞分为对照组、shRNA-NC组、shRNA-Blimp1(5’-GATCTGACCCGAATCAATG-3’)组，对照组为正常培养的细胞，shRNA-NC组和shRNA-Blimp1组细胞分别转染携带无义序列和Blimp-1序列病毒(10 μL 1 × 1011TU/L)，置于细胞培养箱中培养48 h。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测细胞中Blimp-1 mRNA的表达量

TRIzol法提取各组细胞中总RNA，采用反转录酶合成cDNA。根据Genebank中Blimp-1 mRNA的序列，使用Primer 5.0软件设计引物，由上海生工合成，引物序列为：Blimp-1上游序列为5’-TGGACATGGAGGATGCGGATATG-3’，下游序列为5’-AGGTCCTTTCCTTTGGAGGAGTTG-3’；GAPDH上游序列为5’-GGGCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3’，下游序列为5’-GGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’。反应条件为95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。实验重复3次，每组设置5个复孔，采用2-ΔΔCt法计算基因相对转录水平。

1.3.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中Blimp-1蛋白的表达量

收集各组细胞，BCA法定量、稀释，100℃煮沸变性，吸取50 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白质转移至PVDF膜中，封闭液封闭1 h，分别加入一抗稀释液，清洗，加入二抗孵育2 h，ECL显色，曝光，显影，与GAPDH灰度值的比值即为目的蛋白的相对量。

1.3.4 CCK-8检测细胞的增殖

以每孔4 × 104个细胞接种于96孔板中，加入培养基至100 μL，放入37℃、5% CO2细胞培养箱培养46 h，每孔加入5 μL CCK-8溶液，振荡混匀，37℃孵育2 h，酶标仪检测波长450 nm下细胞的吸光值(OD值)。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞的凋亡

收集各组1 × 106个细胞，采用annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒，根据其说明书的指示进行下操作，置于流式细胞仪中计算细胞的凋亡率。实验重复3次，每组设置5个复孔。

1.3.6 Transwell法检测细胞的侵袭能力

将已融化的Matrigel胶加入Transwell上室，37℃培养箱中干燥。收集各组细胞，调整为1 × 106/mL，下室加入600 μL完全培养基，37℃培养24 h；PBS液清洗上室，擦去剩余细胞，酒精固定20 min，染色，100倍显微镜计数，取5个视野的平均值，实验重复3次。

1.3.7 ELISA检测细胞培养液上清中IFN-γ、IL-2的表达量

收集各组培养72 h的细胞上清液，采用IFN-γ、IL-2 ELISA检测试剂盒检测IFN-γ、IL-2的水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组细胞中Blimp-1的表达量

SMMC-7721细胞感染shRNA-NC、shRNA-Blimp1后，RT-PCR和Western blot检测各组细胞中Blimp-1的表达量，结果如表1、图1所示，与对照组相比，shRNA-NC组细胞中Blimp-1 mRNA的表达量无明显变化，shRNA-Blimp1组细胞中Blimp-1 mRNA的表达量较对照组显著降低(P< 0.05)；Western blot结果同样显示，与对照组相比，shRNA-NC组细胞中Blimp-1蛋白水平无明显变化，shRNA-Blimp1组细胞中Blimp-1蛋白水平显著降低(P< 0.05)。

图1 Western blot检测各组细胞中Blimp-1蛋白的表达量Figure 1 Protein expression of Blimp-1 in each group of cells detected by Western blot

2.2 沉默Blimp-1对细胞增殖的影响

采用CCK-8法观察各组细胞的增殖状况，结果如表2所示，与对照组相比，shRNA-NC组细胞的增殖能力无明显变化，shRNA-Blimp1组细胞的增殖能力显著下降，差异有显著性(P< 0.05)。

表1 各组细胞中Blimp-1的表达量Table 1 The expression of Blimp-1 in each group of cells

注：与对照组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表2 沉默Blimp-1对肝癌细胞增殖的影响Table 2 Effect of silencing Blimp-1 on the proliferation of hepatoma cells

注：与对照组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

2.3 沉默Blimp-1对细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪观察各组细胞的凋亡状况，结果如表3、图2所示，与对照组相比，shRNA-NC组细胞的凋亡率无明显变化，shRNA-Blimp1组细胞的凋亡率显著增加，差异有显著性(P< 0.05)。

2.4 沉默Blimp-1对细胞侵袭能力的影响

采用Transwell法分析各组细胞的侵袭能力变化，结果如表4所示，与对照组相比，shRNA-NC组细胞的侵袭数无明显变化，shRNA-Blimp1组细胞的侵袭数显著降低，差异有显著性(P< 0.05)。

图2 沉默Blimp-1对肝癌细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of silencing Blimp-1 on the apoptosis of hepatoma cells

组别Groups凋亡率Apoptosis rate对照组Control group4.215±0.563shRNA-NC组shRNA-NC group4.874±0.521shRNA-Blimp1组shRNA-Blimp1 group13.452±1.415*F值F-value92.258

注：与对照组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表4 沉默Blimp-1对细胞侵袭能力的影响Table 4 Effect of silencing Blimp-1 on cell invasion

注：与对照组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

2.5 沉默Blimp-1对细胞培养液上清中IFN-γ、IL-2表达量的影响

采用ELISA法分析各组细胞上清液中IFN-γ、IL-2水平的变化，结果如表5所示，IL-2在各组间的变化差异不明显；与对照组相比，shRNA-NC组IFN-γ蛋白水平无明显变化，shRNA-Blimp1组IFN-γ蛋白水平显著上调，差异有显著性(P< 0.05)。

表5 沉默Blimp-1对细胞培养液上清中IFN-γ、IL-2表达量的影响Table 5 Effect of silencing Blimp-1 on the expression of IFN-γ and IL-2 in cell culture supernatant

注：与对照组相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

3 讨论

Blimp-1最初被发现在大B细胞淋巴瘤中表达缺失，可能起抑制肿瘤发展的作用[10]。Blimp-1基因位于人常染色体上，具有7个外显子，促进免疫B细胞向浆细胞分化的过程，抑制B细胞增殖相关基因的表达。研究表明，Blimp-1发生突变、转录翻译异常等均可促进大B细胞淋巴瘤的产生，因此推断Blimp-1基因可能具有抑癌基因的作用[11-12]。近年来的研究显示，Blimp-1在肿瘤细胞的生长、分化、以及侵袭、迁移过程中发挥重要作用[13-15]。在肺癌中，采用免疫组织学的方法检测Blimp-1在肺癌组织中的表达量，结果显示，Blimp-1在鳞状细胞肺癌中阳性表达率显著增加，可作为临床诊断的新的标志物和研究治疗靶点[16]。在喉癌组织中，Blimp-1的表达量显著上调，并与患者临床分期和淋巴结转移密切相关，提示Blimp-1基因可作为喉癌早期诊断以及预后判断的重要靶基因[17]。

为探究Blimp-1在肝癌细胞中的作用，本文通过沉默Blimp-1在肝癌SMMC-7721细胞中的表达量，RT-PCR和Western blot检测结果显示，在shRNA-Blimp1组细胞中Blimp-1 mRNA和蛋白较对照组显著降低；CCK-8和流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡，结果显示，与对照组相比，shRNA-Blimp1组细胞的增殖显著降低，凋亡率显著增加；Transwell小室法结果显示，沉默Blimp-1基因显著抑制肝癌SMMC-7721细胞的侵袭能力，表明下调Blimp-1可明显抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡，抑制细胞的侵袭，从而抑制肝癌进一步的发展，在肝癌中发挥抑癌作用，与上述研究结果相一致。

研究发现，Blimp-1不仅对免疫细胞的终末分化以及细胞内稳态具有调控作用，而且对免疫因子的水平具有重要作用[18-20]。在免疫细胞发育、分化和稳定过程中，Blimp-1可与细胞因子IL-2相互作用从而发挥重要的作用[21]。在癌症的发生、发展中，IL-2的表达量具有重要意义[22]。IFN-γ是机体中重要的免疫调节因子，其表达量的增加可以增强细胞的免疫原性，促进细胞凋亡。为了进一步探究Blimp-1在肝癌细胞中的作用，本研究通过ELISA检测各组细胞中IL-2、IFN-γ的表达量，结果发现，沉默Blimp-1基因对肝癌细胞上清中IL-2的表达量无明显影响，但可明显增加IFN-γ的水平，提示Blimp-1可能通过促进IFN-γ的分泌从而抑制肝癌细胞的增殖，诱导其凋亡。

综上所述，沉默Blimp-1促进IFN-γ的表达，显著抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡，降低细胞的侵袭能力，从而阻碍肝癌的进一步恶化，为肝癌的临床治疗和诊断提供了实验基础。