羟喜树碱联合顺铂对骨肉瘤HOS细胞增殖及凋亡的影响研究*

潘润桑，陈致瑜，罗振华，余福勋，杨 斌，聂瑛洁△，田晓滨▲

(1.贵州医科大学研究生院，贵阳 550004；2.贵州省人民医院，贵阳 550001)

骨肉瘤是一种常见的骨组织恶性肿瘤，具有发病率高、恶性程度高、易发生远处转移等特点，早期诊断和治疗较困难[1]。目前虽然有多种手术及化疗治疗方式，但总体治疗效果不理想[2]。目前顺铂仍为骨肉瘤临床治疗常用化疗药，且联合用药对骨肉瘤的治疗将会取得更好的疗效。近年来发现一些中药制剂对骨肉瘤的治疗有一定效果，是目前较为热门的一种新辅助疗法[3]。羟喜树碱是一种能选择性抑制DNA Topo1功能的天然化合物[4]，目前已广泛应用于临床并取得一定治疗效果。羟喜树碱能够抑制多种恶性肿瘤细胞，对肝癌、胃癌、白血病[5-8]等多种肿瘤均有明显的抑制作用。而羟喜树碱在骨肉瘤的治疗作用目前仍不清楚，本实验通过一系列体外实验探讨羟喜树碱对骨肉瘤HOS细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 实验所用骨肉瘤细胞系HOS细胞购自中国典型培养物保藏中心；羟喜树碱(纯度99.91%)购自美国SELLECK公司(批号：S2423)；顺铂购自美国Sigma公司(货号：p4394)；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；CCK-8试剂盒(300T)购自日本Dojindo公司；GAPDH、Cleaved-Caspase3，山羊抗鼠、山羊抗兔等抗体均购自美国CST公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 将骨肉瘤HOS细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基的25 mL培养瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱培养，使细胞均匀贴壁生长，隔天换液，换液时使用PBS清洗。取对数生长期的细胞进行实验。羟喜树碱单药实验分为空白组，10、20、40、80 μmol/L等浓度组。羟喜树碱联合顺铂实验分为空白组，羟喜树碱组(40 μmol/L)，顺铂组(40 μmol/L)及联合用药组(羟喜树碱40 μmol/L+顺铂40 μmol/L)。

1.2.2CCK-8检测细胞活力 胰酶消化细胞后，中和制备细胞悬液，计数。96孔板内每孔接种5 000个细胞，每组5个复孔，按此方法种植HOS细胞于96孔板。分别于24、48、72 h时检测吸光度值(A值)。每孔加入CCK-8 工作液100 μL，细胞培养箱中孵育2 h，酶标仪下检测波长450 nm处A值。

1.2.3平板克隆细胞集落形成实验 胰酶消化细胞，制备单细胞悬液，计数后稀释至1×103个/mL。在6 cm培养皿中加入1 000个细胞，待细胞贴壁后分别给药。培养2周后，以4%多聚甲醛固定30 min，2%结晶紫染色30 min，洗净烘干后拍照。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 加药处理24、48、72 h，收集上清液于流式管，PBS清洗后加1 mL不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，中和后收集于流式管，800 r/min离心5 min，弃上清液。PBS清洗干粉，800 r/min离心5 min，弃上清液。每组加入200 μL 1×Binding Buffer,在Buffer中加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，混匀；4 ℃避光反应15 min；流式细胞仪上机检测，记录结果。

1.2.5Western blot 提取各实验组细胞的蛋白，通过电泳、转膜、洗膜，一抗4 ℃摇床孵育16 h，二抗室温孵育1 h，洗膜，在化学发光试剂盒电化学发光(ECL)液中于凝胶成像系统下曝光，以GAPDH为内参照。

2 结 果

2.1羟喜树碱对HOS细胞增殖的影响 与空白组比较，不同浓度羟喜树碱作用均出现明显的抑制作用(P<0.05)，且细胞活性随着时间及浓度的增加逐渐降低(P<0.05)。随着羟喜树碱浓度的增加，HOS细胞克隆形成的细胞团明显减小，细胞集落数量形成逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：CCK-8检测细胞活力；B：平板克隆细胞集落形成实验

2.2羟喜树碱对HOS细胞凋亡的影响 随着羟喜树碱浓度的增加，HOS细胞发生凋亡的比例明显升高(P<0.05)，细胞凋亡率分别为7%、17%、26%、34%、53%；凋亡相关蛋白Caspase3剪切体表达逐渐增加；与空白组相比，其余组Caspase3剪切体、Bax表达上调(P<0.05),40、80 μmol/L组更为明显(P<0.01)，见图2。

2.3羟喜树碱联合顺铂对HOS细胞增殖的影响 与空白组比较，羟喜树碱组、顺铂组及联合用药组均在不同时间对HOS细胞出现抑制作用。羟喜树碱组及联合用药组的抑制率分别为(65.5±3.9)%和(73.0±4.6)%，联合用药组对细胞活力抑制作用最强，差异有统计学意义(P<0.05)。联合用药组相比于其他组，HOS细胞克隆形成的细胞团明显减小(P<0.05)，见图3。

A：流式细胞术检测细胞凋亡；B：Western blot检测相关蛋白

A：CCK-8检测细胞活力；B：平板克隆细胞集落形成实验

A：流式细胞术检测细胞凋亡；B：Western blot检测相关蛋白

2.4羟喜树碱HYD联合顺铂对HOS细胞凋亡的影响 与羟喜树碱组、顺铂组相比，联合用药组HOS细胞发生凋亡的比例最高(P<0.05)，凋亡相关蛋白Caspase3剪切体、Bax表达量最高(P<0.05)，见图4。

3 讨 论

骨肉瘤好发于青少年，是最常见的原发性恶性骨肿瘤疾病之一[9]。目前的治疗方式主要为手术切除及放化疗[10]。虽然化疗方式有一定效果，然而治疗效果仍较差，有效率60%左右[11]。因此，寻找新的抗骨肉瘤细胞恶性生物学行为的药物显得尤为重要。

羟喜树碱是我国自主研发的新型抗肿瘤药物，其药理学功能主要是不可逆的抑制DNA复制[12]。目前在临床有较为广泛的应用，尤其在肿瘤的治疗中有一定的成效。在结直肠的联合化疗中，羟喜树碱联合奥沙利铂与单用奥沙利铂组相比，其诱导的肿瘤细胞凋亡率明显增加[13]。有文献报道羟喜树碱抑制肝癌细胞增殖具有浓度依赖性，并能引起细胞发生明显凋亡相关改变[14]。目前，由于其在肿瘤治疗存在一定的有效性，近年研制出了片剂、滴丸、固体分散片、脂质体、纳米体等一系列新剂型[15]。羟喜树碱对治疗多种恶性肿瘤具有明显疗效，然而其在骨肉瘤中的临床作用仍不清楚，有待进一步研究。

本研究显示，随着羟喜树碱浓度的增加和作用时间的延长，其对细胞的抑制作用逐渐增加，呈现出时间和剂量依赖性，细胞集落形成数量及大小均降低，细胞凋亡比例明显增高，凋亡相关蛋白Caspase3、Bax表达逐渐增加，Bcl2表达逐渐降低，表明羟喜树碱促进HOS细胞的凋亡，提示羟喜树碱对骨肉瘤细胞有明显的抑制作用。羟喜树碱在联合顺铂用药后，显示出了更加明显的抑制肿瘤增殖的反应。

以上实验均表明羟喜树碱能够在体外抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖，促进其凋亡，联合顺铂用药较单用顺铂化疗效果更佳，为临床治疗骨肉瘤提供新的思路和实验基础。然而具体相关机制尚不清楚，有待进一步深入研究。