妇炎汤对急性盆腔炎模型大鼠子宫、卵巢JNK/p38信号通路影响*

刘 艺 邓琳雯 谢 萍

（成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075）

盆腔炎属于临床常见妇科炎症，常累及卵巢、子宫，导致输卵管炎、输卵管卵巢炎，子宫内膜炎等，病情加重则发展为感染性休克、败血症等，严重危害妇女身心健康，因此探究其发病机制，对于急性盆腔炎的治疗、预后均有十分积极的意义［1］。c-Jun氨基末端激酶（JNK）/p38信号通路为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路重要成员，参与多种炎症疾病的发生［2］，近期动物研究显示JNK信号通路参与盆腔炎的发生，抑制通路活性后，可抑制炎症因子的表达，进而缓解病情［3］。慢性盆腔炎中研究显示，抑制p38信号通路后可抑制巨噬细胞浸润，进而缓解炎症反应［4］。以上研究均表明JNK/p38信号通路可能与盆腔炎的发生有关。本研究通过制备急性盆腔炎大鼠，并给予妇炎汤治疗，以探究妇炎汤对JNK/p38信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雌性Wistar大鼠72只，体质量200~220 g，8周鼠龄，购于河南省医药科学研究院，许可证号：SYXK （豫）2016-0008。所有大鼠均在同一条件下饲养，恒温25℃，湿度为50%，期间大鼠自由饮水、摄食，饲养1周后进行模型制备。

1.2 试剂与仪器 1）试药：妇炎汤（组成：丹参、薏苡仁、败酱草各20 g，金樱子根10 g，栀子8 g），置于冷水中浸泡1 h，蒸煮30 min后浓缩至质量浓度为2 g/mL。妇科千金片，株洲千金药业股份有限公司生产，批号：161013，规格：0.32 g/片。解脲支原体、大肠杆菌（菌种号：336902）、金黄色葡萄球菌（菌种号：186335）购于北纳生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自于碧云天公司，批号：20160916、20160725；兔抗鼠JNK、p-JNK、p38、p-p38抗体均购自于美国Gibco 公司， 批号分别为 20160803、20160912、20160819、20160725；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二体、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 抗体购自于美国 Amresco公司，批 号 分 别 为 20161014、 20100924、20160922、20161003、20161017；结晶紫染液购自于北京中杉金桥生物技术有限公司批号：20161013。2）仪器：倒置显微镜购于Olympus公司，批号：20130607；蛋白凝胶成像仪购自于Bio-Red公司，批号：20131117。

1.3 分组及造模 72只大鼠随机抽取12只作为假手术组，剩余大鼠造模。参照文献［5］制备大鼠急性盆腔炎模型，除假手术组外，其余60只大鼠均采用3%戊巴比妥钠麻醉后，注射0.5 mL浓度为3×1012/L的菌悬液（支原体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌三者比例为1∶1∶1混匀），在阴道底部子宫颈分叉处进针进入宫腔中，并在宫腔中反复抽拉造成子宫内膜机械损伤，随后沿卵巢方向注入0.1 mL混合菌悬液，按照同样操作将等量菌液注入另侧宫腔，结束后将海绵置于阴道底部以防渗出。假手术组大鼠操作与模型组相同，但沿卵巢方向仅注射等量生理盐水。大鼠造模成功后，随机分为模型组、妇炎汤治疗组（低、中、高剂量）、阳性组（妇科千金片）各12只。

1.4 干预方法 造模结束后第5日，妇炎汤低、中、

高、剂量组分别予妇炎汤 4、8、16 g/（kg·d）进行给药。阳性组给予妇科千金片，剂量为0.2 g/（kg·d）。假手术组给予等容积蒸馏水50 mL，所有大鼠每天均给药1次，连续给药3周。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 组织学观察 给药结束后次日清晨，采用7.5 mL/kg乌拉坦麻醉后，将大鼠断头处死，分别获取卵巢、子宫组织，将组织中一部分置于10%多聚甲醛中固定，另一部分置于-80℃冰箱中进行保存。将固定后的组织进行石蜡包埋、切片及HE染色，置于显微镜下观察组织病理学改变。组织病理学评分，子宫、卵巢等组织未出现出血、水肿、炎症细胞浸润等为0分；结构不清晰，出现轻度水肿，少量炎性细胞浸润为1分，组织结构模糊，出血、水肿以及出现炎症细胞浸润为2分；组织被破坏，结构模糊，出现大量炎症细胞浸润为3分。

1.5.2 外周血细胞测定 大鼠断头处死后取血，采用血细胞分析仪测定血液中淋巴细胞、白细胞、嗜酸性粒细胞等。

1.5.3 蛋白免疫印迹法检测JNK/p38信号通路、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白 取出保存子宫、卵巢组织，加入IPA裂解缓冲液冰上放置30 min，采取蛋白提取试剂盒提取组织中总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。用SDS-PAGE分离等量蛋白质，并转移至PDVF膜上，置于4℃下添加一抗与β-actin（1∶500）孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶500）常温下孵育2 h。采用ECL发光试剂显影后，使用Quantity One软件分析蛋白相对表达水平。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两对比采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组外周血中细胞测定结果比较 见表1。与假手术组相比，模型组白细胞数、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜中粒细胞数均升高（P＜0.05）。与模型组相比，各给药组白细胞数、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜中粒细胞数均降低，具有剂量依赖性（P＜0.05）。

表1 各组外周血白细胞数量测定结果比较（±s）

表1 各组外周血白细胞数量测定结果比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与中剂量组比较，◇P＜0.05。 下同

组 别 n假手术组 12模型组 12低剂量组 12嗜酸粒细胞（%）嗜中粒细胞（%）2.12±0.36 29.13±2.10 3.63±0.27* 70.92±3.87*3.14±0.15# 51.65±2.98#中剂量组 12 1.24±0.32#△ 42.13±2.33#△ 3.59±0.19#△ 2.78±0.33#△ 42.08±2.24#△高剂量组 12 1.11±0.25#△◇ 51.76±2.74#△◇ 3.32±0.34#△◇ 2.32±0.36#△◇ 33.10±3.17#△◇阳性组 12 1.06±0.31# 52.84±2.83# 3.29±0.26# 2.02±0.26# 26.13±2.07#白细胞数（×109/L） 淋巴细胞（%）单核细胞（%）1.08±0.16 21.63±2.84 3.52±0.41 1.67±0.42* 61.65±2.87* 5.23±0.39*1.43±0.35# 33.48±2.57# 4.44±0.27#

2.2 各组卵巢、子宫组织病理学检测结果 见图1~图2，表2。假手术组卵巢组织正常，未出现充血、炎症细胞浸润；模型组卵巢严重充血和出血，且出现大量炎症细胞浸润；妇炎汤低剂量组仍存在充血，高剂量组充血、出血明显减少；阳性组卵巢基本恢复正常，见图1。假手术组子宫壁组织分界清晰，上皮细胞排列整齐，血管无充血、炎症浸润；模型组子宫壁组织分界模糊，上皮细胞出现坏死、脱落，出现水肿，血管充血以及炎症细胞浸润；经妇炎汤、妇科千金片治疗后，上述症状均得到缓解，见图2。与假手术组相比，各给药组卵巢、子宫病理评分均升高；与模型组相比，各给药组卵巢、子宫病理评分均降低，且妇炎汤作用具有剂量依赖性（P＜0.05），见表 2。2.3 各组子宫、卵巢中JNK/p38信号通路蛋白表达见图3~图4，表3。与假手术组相比，模型组p-JNK、p-p38蛋白表达升高；与模型组相比，各给药组p-JNK、p-p38蛋白表达降低，且妇炎汤作用具有剂量依赖性（P＜0.05）。各组间JNK、p38蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。

图1 卵巢组织病理检测结果（HE染色，200倍）

图2 子宫组织病理检测结果（HE染色，200倍）

表2 各组大鼠卵巢、子宫组织病理评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠卵巢、子宫组织病理评分比较（分，±s）

组 别 n 卵巢 子宫假手术组 12 0.16±0.04 0.15±0.04模型组 12 3.56±0.65* 3.44±0.35*低剂量组 12 2.47±0.53# 2.87±0.63#中剂量组 12 1.88±0.62#△ 2.18±0.35#△高剂量组 12 1.26±0.38#△◇ 1.56±0.42#△◇阳性组 12 0.64±0.18# 1.14±0.17#

图3 子宫组织中JNK/p38信号通路蛋白表达

图4 卵巢组织中JNK/p38信号通路蛋白表达

表3 各组大鼠组织中JNK/p38信号通路蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠组织中JNK/p38信号通路蛋白表达比较（±s）

组 别 n 子宫假手术组 12 JNK p-JNK p-JNK p38 p-p38 0.88±0.09 0.21±0.03 0.73±0.16 0.18±0.03卵巢JNK p-JNK p-JNK p38 p-p38 0.75±0.12 0.34±0.04 0.63±0.06 0.15±0.04模型组 12低剂量组 12中剂量组 12高剂量组 12阳性组 12 0.85±0.07 0.92±0.16* 0.77±0.15 1.14±0.23*0.83±0.08 0.77±0.12# 0.74±0.16 0.86±0.18#0.89±0.06 0.46±0.42#△ 0.79±0.14 0.68±0.14#△0.88±0.09 0.31±0.04#△◇ 0.73±0.16 0.37±0.03#△◇0.85±0.07*0.27±0.06# 0.77±0.21 0.34±0.05#0.77±0.14 1.22±0.08* 0.67±0.05 1.12±0.26*0.79±0.14 0.92±0.09# 0.64±0.06 0.87±0.05#0.78±0.15 0.77±0.06#△ 0.69±0.04 0.66±0.12#△0.73±0.14 0.49±0.08#△◇ 5.13±0.96 0.41±0.05#△◇0.77±0.09 0.38±0.03# 6.07±1.25 0.22±0.05#

2.4 各组子宫、卵巢中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 蛋白表达比较 见图5~图6，表4。与假手术组相比，模型组子宫、卵巢中TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表达升高，IL-10蛋白表达降低；与模型组相比，各给药组子宫、卵巢中 TNF-α、IL-1β、IL-8 蛋白表达降低，IL-10 蛋白表达升高，且妇炎汤作用具有剂量依赖性（P＜0.05）。

图5 子宫组织中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白表达

图 6 卵巢组织中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白表达

表 4 各组子宫、卵巢组织中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 表达比较（±s）

表 4 各组子宫、卵巢组织中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 表达比较（±s）

组 别 n 子宫假手术组 12 TNF-α IL-1β IL-8 IL-10 0.18±0.03 0.14±0.03 0.13±0.03 1.06±0.23卵巢TNF-α IL-1β IL-8 IL-10 0.15±0.02 0.14±0.03 0.23±0.03 0.22±0.05模型组 12低剂量组 12中剂量组 12高剂量组 12阳性组 12 1.24±0.15* 0.84±0.05* 1.07±0.25* 0.37±0.06*0.89±0.13# 0.67±0.08# 0.74±0.15*# 0.55±0.13#0.58±0.14#△ 0.53±0.06#△ 0.56±0.14*#△ 0.68±0.19#△0.43±0.06#△◇ 0.38±0.05#△◇ 0.43±0.08#△◇ 0.97±0.08#△◇0.24±0.05# 0.25±0.02# 0.32±0.03# 1.02±0.32#1.17±0.24* 0.82±0.08* 1.07±0.13* 0.15±0.04*0.95±0.14# 0.67±0.09# 0.84±0.06# 0.87±0.05#0.78±0.07#△ 0.41±0.06#△ 0.69±0.04#△ 0.66±0.12#△0.43±0.06#△◇ 0.49±0.0#△◇ 0.43±0.11#△◇ 0.41±0.05#△◇0.22±0.04# 0.38±0.03# 0.37±0.04# 0.91±0.05#

3 讨 论

急性盆腔炎在中医学中属于 “带下”“腹痛”等范畴，主要由于气滞、正气不足、湿热等引起，因此应将清热利湿、活血化瘀、益气扶正等作为治疗目的［6］。妇炎汤中的丹参可促行气，败酱草可清热解毒，金樱子根可活血化瘀，薏苡仁可利水渗透湿，对急性盆腔炎的治疗具有一定的功效。高薇炜研究显示妇炎汤对慢性盆腔炎治疗效果较好，能够促进血循环，提高患者机体自身抗炎力［7］。马德芬研究显示妇炎汤对湿热型盆腔炎治疗效果较好，患者治疗后带下量多及腹痛等症状均得到明显改善［8］。以上研究均表明妇炎汤治疗盆腔炎疗效较好，但对于其作用机制，目前研究不多，本研究通过制备急性盆腔炎模型大鼠，给予妇炎汤治疗，以探究妇炎汤作用机理。

机体发生急性或慢性炎症反应时候外周血中白细胞数量也会出现不同的变化，不同类型的白细胞比例也会发生改变［9］，本研究通过对大鼠外周血中血细胞成分进行分析显示，模型组白细胞数、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜中粒细胞数均明显高于假手术组，病理结果提示模型组子宫、卵巢组织均出现充血、炎症细胞浸润，提示急性盆腔炎大鼠模型制备成功。在经妇炎汤治疗后白细胞数、淋巴细胞、单核细胞等均明显降低，子宫、卵巢组织中炎性细胞浸润得到明显缓解，提示妇炎汤可能通过调控机体免疫力发挥抗炎作用。另有研究显示妇炎汤可降低急性盆腔炎大鼠炎症反应，降低组织内炎性细胞的浸润［10］，这一观点支持本研究结果，但其具体药理机制，目前尚不清楚。

JNK、p38为MAPK家族成员，参与较多炎症反应，是重要的炎性信号通路。研究显示机体受到炎症损伤可导致JNK、p38发生磷酸化，促进细胞释放较多炎性因子，进而活化中性粒细胞等炎性因子，放大炎症反应［11］。研究显示促进JNK信号通路，可能促进卵巢癌细胞的增殖促进其侵袭、迁移［12］。在氟化钠诱导的子宫内膜炎中研究显示，p38磷酸化水平明显升高，提示p38可能参与子宫内膜炎的发生［13］。本研究发现，模型组子宫、卵巢组织中p38、JNK磷酸化水平增加，提示JNK/p38信号通路的活化与子宫、卵巢组织炎症损伤有关。梁照研究发现化瘀通络法能明显降低大鼠盆腔组织MAPK活性及蛋白表达水平，抑制MAPK活化，可降低盆腔组织炎症损伤［14］。与此一致，本研究结果显示经妇炎汤治疗后p38、JNK磷酸化水平降低，提示妇炎汤可能通过抑制JNK/p38信号通路磷酸化进而发挥抗炎作用，减轻组织炎症损伤。

JNK/p38信号通路能够被炎症、缺血、缺氧等激活。研究发现，炎症因子通过使JNK/p38通路蛋白磷酸化，扩大炎症反应，进一步促进炎性细胞释放促炎细胞因子，加重炎症损伤［15］。尤良震等发现，大鼠组织中p-JNK、p-p38表达的上调与 IL-1β、TNF-α等炎症因子水平上调一致，证实JNK/p38信号通路的激活能够促进炎性细胞因子释放加重炎症损伤［16］。本研究进一步对信号通路下游有关炎症因子进行检测，结果显示模型组 TNF-α、IL-1β、IL-8 蛋白表达升高，IL-10 蛋白表达降低。给予妇炎汤治疗后，子宫、卵巢中TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表达降低，IL-10蛋白表达升高，结合过往研究推测，妇炎汤能够抑制子宫、卵巢组织中JNK/p38信号通路激活，减少炎症细胞因子分泌，进一步抑制炎症细胞因子相关基因的表达，减少组织中炎性细胞浸润，缓解子宫、卵巢组织炎症损伤。

综上所述，妇炎汤对急性盆腔炎大鼠具有保护作用，这可能与抑制子宫、卵巢组织中JAK2/STAT3信号通路激活有关。然而，本研究中妇炎汤仅能部分缓解组织损伤及炎症反应，而非完全逆转组织损伤，这可能与药物剂量有关，也有可能受其他因素的影响，这还有待后续深入探究，以期为急性盆腔炎的治疗提供更有力的证据。