原发性肺癌患者结核分枝杆菌的耐药性检测

阮红刚， 付潮泓， 许腊梅

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率均呈上升趋势[1]。原发性肺癌是指癌变起源于肺内组织，常因肺内支气管上皮、支气管腺体、肺泡上皮等部位异常改变，进而引发癌变[2]。有文献报道 ，肺癌的发生与结核分枝杆菌-L型（MTB-L）感染存在密切联系，可能为该病的新诱因[3]。MTB-L是MTB常见的变异类型，其发生常因各种不利因素共同作用，进而诱导基因发生突变，造成细胞壁结构部分或完全缺失所致[4]。国外有研究发现，MTB-L某些小的原生质体及滤过相与病毒存在一定相似度，因此感染后常可进入人体体细胞，并可将自身DNA整合到侵入细胞染色体上，激活原癌基因及抑制抑癌基因可能是引起癌变的主要原因[5]。同时MTB-L还可以依靠血液中抗体、补体、溶酶素及其可抑制免疫细胞活性而长期存在，再通过黏附红细胞表面向全身扩散[6]。由于MTB-L的细胞壁存在缺陷，因此对药物敏感性改变较大，同时在普通培养基中存活率较低，加大临床诊断难度。鉴于MTB-L对癌症的一系列作用，因此对其有效的检测及耐药性分析，对临床诊治意义重大。本文对原发性肺癌患者的MTB-L及其耐药性检测结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年6月－2015年8月收治的原发性肺癌患者89例。纳入标准：①均满足2015新版《原发性肺癌诊疗指南》中的诊断标准[7]；②术后病理学检查证实为原发性肺癌，且检查前未接受抗癌治疗；③均未接受放疗、化疗及免疫治疗。排除标准：①合并严重的心脑血管、肝肾器官组织疾病；②继发性肺癌患者；③合并严重免疫系统、血液系统、传染性疾病患者；④长期服用抗菌药物治疗患者。所有患者中男性54例、女性35例，平均年龄为（48.8±7.4）岁（31～72岁），平均肿瘤直径为（3.35±0.84）cm，其中腺癌患者41例、鳞癌患者25例、细支气管肺泡癌患者14例、小细胞未分化癌患者9例；组织学分级为I级患者31例、II级患者42例、III级患者16例。

1.2 方法

采用原位分子杂交技术（in situ hybridiation，ISH）对MTB-L的MPB64基因片段进行检测，从MTB H37RV标准株的MPB64基因片段选取My2500224和My310283片段，采用深圳市华荣发电子测试有限公司生产的合成探针和生物素对其进行标记，MPB64探针合成序列：5'-CGGTA TCGGT GCCTT TCAAC TCCTC GC-3'和 5'-GGGCA GGCTGATGTT GATGT TGTAGGC-3'，同时本研究中为提高检测率，将其进行混合使用，将石蜡包埋的组织标本进行常规脱蜡，所有步骤均参照ISH试剂盒中的操作说明书进行。采用IK抗酸染色对MTB-L进行检测。同时对检测出的MTB-L感染阳性患者的痰液标本以平板划线法进行MTB-L分离，具体方法为：用接种环以无菌操作蘸取少许痰液，在无菌培养皿表面进行连续划线，随时间延长，培养皿上生长的典型“油煎蛋”状菌落即为L型菌落，挑取目标菌落多次重复上述操作，达到分离纯化的目的。并对分离株行利福平及异烟肼等药物的药敏试验，药敏试验操作严格参照文献[8]中拟定操作进行 。

1.3 观察指标

观察所有原发性肺癌患者肺癌组织标本中MTB-L阳性检出率，同时对阳性痰标本进行MTB-L分离和药敏试验，对肺癌组织中MTB-L检测阴性者痰标本以同样的方法进行MTB-L分离，观察菌落生长情况。统计MTB-L对各类抗菌药物的耐受性，并比较多重耐药（MDR）与广泛耐药（XDR）的MTB-L对各种抗菌药物耐药性差异。

1.4 统计学方法

本研究所有记录结果均由2人建立数据库，所有数据采用SPSS 19.0统计学软件处理，计数资料以[n（%）]表示，并采用χ2检测，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTB和MTB-L阳性检出率

在89例原发性肺癌组织标本中检测出34例MTB-L阳性，阳性率为38.2%，阳性患者痰标本均分离到MTB-L菌株，共计63株，阴性患者痰标本均未见MTB-L特征性菌落生长。34例MTB-L阳性患者中腺癌患者15例，鳞癌患者10例，细支气管肺泡癌患者5例，小细胞未分化癌患者4例，结果显示不同组织分型患者MTB-L阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果显示原发性肺癌患者以MTB-L感染为主，几乎无MTB感染。

2.2 MTB-L对一线抗结核药耐药性

63株MTB-L对一线抗结核药物的耐药率为57.1%（36株），其中对异烟肼单药使用的耐药率为6.3%，对异烟肼联合链霉素、利福平、乙胺丁醇使用的耐药率为20.6%，见表1。

2.3 MTB-L对二线抗结核药耐药性

MTB-L对二线抗结核药物的耐药率为31.7%（20株），其中对氧氟沙星单药使用的耐药率为11.1%，对氧氟沙星联合卷曲霉素、阿米卡星使用的耐药率为7.9%，见表2。

表1 63株MTB-L对一线抗结核药物耐药率Table 1 Resistance of 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains to the first line anti-tuberculosis drugs

表2 63株MTB-L对二线抗结核药物耐药率Table 2 Resistance of 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains to the second line anti-tuberculosis drugs

2.4 MDR和XDR的MTB的耐药率比较

63株MTB-L 中MDR株占36.5%，XDR株占12.7%，MDR菌株的耐药率明显高于XDR菌株（χ2=9.63，P=0.001），见表3。

表3 63株MTB-L 中MDR与XDR株的耐药率比较Table 3 Comparative resistance rates of multi-drug resistant （MDR） and extensively drug ressitant （XDR） strains in the 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains

3 讨论

肺癌作为临床最为常见的恶性肿瘤，调查显示，近50年世界各国肺癌发生率及病死率均明显上升，已占男性恶性肿瘤中发病率及病死率的首位，同时占女性恶性肿瘤发病率及病死率的第二位[9]，严重威胁着人们的健康及生命。大量研究已证实，吸烟及二手烟是肺癌发生的最重要因素，烟草中大量化学物质具有致癌作用，可导致细胞转化引起癌变。随着对肺癌研究深入，有研究发现，MTB-L在原发性肺癌患者的肿瘤组织中具有较高的检出率，且相关研究显示，MTB-L也具有一定致病性[10]，可能在肺癌发生发展过程中起着重要作用，但目前还无确证报道。有研究认为MTB-L的致肺癌发生可能为：①MTB-L能够进入肺泡上皮细胞中的细胞核，并将DNA整合到细胞核染色体上，激活原癌基因及抑制抑癌基因，诱导细胞癌变；②MTB-L可引起组织持续性慢性炎性反应，造成肺组织过度增生；③肺组织中局部结核性支气管扩张钙化及瘢痕的产生，使局部静脉淋巴回流受阻，致大量致癌物质聚集刺激邻近肺组织诱发癌变[11]。也有研究显示，在MTB-L感染的肺癌组织中脆性组氨酸三联体蛋白相比正常组织存在明显异常表达，结果显示MTB-L发挥致癌作用可能与改变某些基因有关[12]。本研究中对89例原发性肺癌组织中MTB-L检测显示，MTB-L的阳性表达率为38.2%，而MTB阳性表达率仅为1.1%，结果表明MTB-L感染可能与原发性肺癌发生存在相关性。

根据WHO关于肺癌的组织学分型，主要分为鳞癌、腺癌、小细胞癌、细支气管肺泡癌及大细胞癌，且研究证实不同组织分型肺癌组织中基因表达存在明显差异，因此有学者认为MTB-L可能在不同组织分型肺癌中阳性表达率存在差异性。本研究以MTB MPB64基因片段为探针，采用IK抗酸染色方法对MTB-L的阳性表达及存在部位进行检测，结果显示不同组织分型肺癌组织中MTB-L阳性表达率无明显差异（P＞0.05），与国内王梅梅等[13]报道一致。同时本研究还对肺癌MTB-L阳性表达组织中分离出的MTB-L进行药敏试验， MTB-L对一线抗结核药物的耐药率为57.1%，对二线抗结核药物的耐药率为31.7%，其中对一线抗结核药物异烟肼和链霉素具有较高耐药率，且对于异烟肼单药使用及异烟肼与其他药物联合使用均具有一定耐药性，因此临床治疗中应减少对异烟肼的使用。有研究还发现[14]，MTB-L对二线抗结核药物均存在较高耐药性，本研究显示氧氟沙星耐药率最高达11.1%，因此临床需避免氧氟沙星单药使用。此外本研究还对MDR和XDR的MTB的耐药率进行比较，结果显示XDR菌株的耐药率为12.7%，明显低于MDR菌株的耐药率36.5%（P＜0.01），且发现4种药物联合使用的耐药率明显高于3种或2种药物联合使用，提示多种抗结核药物治疗可能使疗效降低，还能增加耐药性[15]，因此临床不建议3种以上药物联合治疗。

综上所述，原发性肺癌患者以MTB-L感染为主，MTB-L对异烟肼及二线抗结核药物存在较高耐药率，且多药联合使用可能会降低疗效，增加MTB-L耐药率。临床治疗中应结合患者情况、药物耐药性检测，合理选用抗菌药物。