结核感染T细胞斑点试验在结核性胸膜炎患者中假阴性的危险因素分析

邹兴武， 周 华， 符一骐， 周建英

结核性胸膜炎由结核分枝杆菌（MTB）通过淋巴、血行或胸膜下肺部结核病灶直接蔓延至胸膜，引起胸膜介导的免疫反应，产生胸腔积液引起的。在单侧胸腔积液病原菌中MTB占30%～60%。结核性胸膜炎缺乏典型的临床表现和影像学特征，传统的实验室诊断方法阳性检出率低，而逐渐开展的胸膜活检或胸腔镜检查属于有创性检查，特别对老年患者应用有一定限制，对结核性胸膜炎的早期诊断有一定的局限性[1-2]。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种针对结核感染的体外诊断试验，该方法应用MTB的RD1区域编码早期分泌抗原靶蛋白-6（ESAT-6）和培养滤过蛋白-10（CFP-10）作为特异性抗原，检测外周血效应T细胞经过抗原刺激后分泌γ干扰素的情况。结核病患者中，T-SPOT.TB的总体灵敏度85.0%，特异度92.5%。由于它无法区分活动性结核与潜伏结核感染，目前认为其阴性结果时，临床首选排除结核病诊断[3-4]。文献报道高龄、服用非甾体药物、外周血单个核细胞减少等因素会造成T-SPOT.TB假阴性[5-8]。本文以特定的结核性胸膜炎患者为研究对象，对影响T-SPOT.TB假阴性的可能危险因素进行筛选及分析，以期提高T-SPOT.TB试验在结核性胸膜炎中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取浙江大学医学院附属第一医院2014年1月－2015年6月收治住院的诊断为结核性胸膜炎并行T-SPOT.TB检查的患者。诊断标准参照中华人民共和国卫生行业标准WS 288—2017版；临床诊断病例：结核性胸膜炎患者，胸水表现为渗出液、腺苷脱氨酶（ADA）升高。同时具备下列条件之一者：结核菌素皮肤试验中度阳性或强阳性、干扰素释放试验阳性、MTB抗体阳性，并排除其他肺部疾病。确诊病例：①胸水病原学检查，符合涂片显微镜检查阳性或分枝杆菌培养阳性，菌种鉴定为MTB复合群；②胸膜病理学检查符合结核改变者。排除标准：①年龄＜18岁；②病例资料不齐；③随访不足12个月；④培养结果为非结核分枝杆菌；⑤长期使用激素；⑥HIV感染者；⑦患有免疫系统疾病。共有239例患者纳入研究，根据T-SPOT.TB的检测结果，分为假阴性组和阳性组。T-SPOT.TB假阴性组33例患者中，男24例，女9例，年龄平均（55.6±17.0）岁；合并肺外结核8例（24.2%），其中结核性腹膜炎2例、结核性心包炎5例、肠结核1例。T-SPOT.TB阳性组206例患者中，男137例，女69例，平均（41.1±17.7）岁；合并肺外结核11例（5.3%），其中结核性腹膜炎7例、结核性心包炎2例、结核性脑膜炎1例、结核性盆腔炎1例。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

收集患者的临床特征及实验室数据等进行单因素分析。将P＜0.05的单因素纳入两组间多因素logistic回归分析，同时将年龄按青年组（18～39岁）=1、中年组（40～59岁）=2、老年组（60岁以上）=3赋值设置虚拟变量进行分层分析。由于部分患者入院后因胸水量少，未行胸水常规、生化检查，为提高多因素logistic回归分析统计意义，未将胸水的相关检验值纳入多因素logistic回归分析。

T-SPOT.TB的实验室操作：采用Oxford Immuunotec Ltd的T-SPOT.TB试剂盒并严格按照试剂盒说明进行，肉眼观察结果，计数着色的斑点。以任一个ESAT-6或CFP-10检测孔达到以下标准判定为阳性：如果阴性对照孔斑点数＜5个，以检测孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6为阳性； 如果阴性对照孔斑点数为6～10个，以检测孔斑点数≥2倍的阴性对照孔斑点数为阳性，如果上述标准不符合且阳性对照孔正常时检测结果为阴性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计分析软件。临床数据符合正态分布的以均数±标准差表示，不符合正态分布以中位数（四分位数间距）或相应例数表示，用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验来比较分析组间指标。计数资料采用频数及百分数表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验，均以P＜0.05为差异具有统计学意义。多因素分析采用logistic逐步回归。

2 结果

2.1 与T-SPOT.TB假阴性结果相关的单因素分析

单因素分析发现年龄、吸烟、饮酒、入院前病程、抗结核治疗、T-SPOT.TB检查前给予胸腔抽液检查、合并肺外结核、血红蛋白、外周血淋巴细胞计数、外周血单核细胞计数、胸水白细胞计数、胸水淋巴细胞百分比、胸水总蛋白、胸水ADA与T-SPOT.TB假阴性结果存在显著相关（表 1）。

表1 结核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假阴性危险因素的单因素分析Table 1 Univariate analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

2.2 与T-SPOT.TB 假阴性结果相关危险因素多因素logistic回归分析

在单因素分析的基础上，将年龄、血红蛋白、外周血淋巴细胞计数、入院前时间、既往肺结核、抗结核治疗、T-SPOT.TB检查前给予胸腔抽液检查、吸烟、饮酒和合并肺外结核采用多因素偏最大似然估计法逐步logistic回归分析发现年龄是独立危险因素。对年龄进行分层分析后发现，随年龄的增长，出现T-SPOT.TB假阴性的风险越高。另外T-SPOT.TB检查前曾行胸腔抽液检查、抗结核治疗、合并肺外结核是T-SPOT.TB假阴性的独立危险因素。而外周血淋巴细胞计数是T-SPOT.TB假阴性的保护因素，提示外周血淋巴细胞数量越多，发生假阴性的风险越小，淋巴细胞减少是T-SPOT.TB假阴性的独立危险因素（表2）。

表2 结核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假阴性危险因素的多因素logistic回归分析结果Table 2 Multivariate logistic regression analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

3 讨论

新发肺结核患者中伴有结核性胸膜炎者占4.7%～17.6%[9]。该疾病常常急性起病，胸膜纤维化等并发症发生率较高。因此该疾病的早期诊断、及时有效的治疗对改善患者预后有重要的意义。近年来，T-SPOT.TB检测技术因其较高的灵敏度和特异度，在结核性疾病的诊断中得到广泛关注。该技术是使用MTB特异性抗原刺激外周血T淋巴细胞，应用酶联免疫斑点方法，对能分泌γ干扰素的抗原特异性效应T淋巴细胞进行计数，从而判断结核感染状态，缺点是无法区分活动性结核与潜伏结核感染，临床工作中阴性结果更有意义。所以近年来，对其假阴性影响因素的研究受到人们的关注。2009年Liao等[7]报道在肺结核患者中高龄和接受激素治疗是T-SPOT.TB假阴性的危险因素 ，2013年Lee等[8]对128例肺外结核患者的研究中发现仅结核性脑膜炎与T-SPOT.TB假阴性有关，而年龄、性别、HIV感染、是否合并肺结核等因素无统计学意义 。2015年Pan等[5]再次的大样本研究结果显示，在肺结核患者中年龄、超重、发病时间＞6个月，在肺外结核患者中高龄是T-SPOT.TB假阴性的危险因素 。总之，目前T-SPOT.TB假阴性影响因素的相关研究较少，且未有针对某一类型结核性疾病的研究，难以个体化应用于临床。

本文采用多因素logistic回归分析发现在结核性胸膜炎患者中年龄、外周血淋巴细胞数量、合并肺外结核、抗结核治疗是T-SPOT.TB试验假阴性结果的独立危险因素。随着年龄的增长，T-SPOT.TB假阴性的概率逐渐升高，结合国内外相关研究，分析其可能的机制是随着年龄的增长，人体固有免疫和适应性免疫能力均相对下降，而T细胞作为免疫反应过程中的重要部分，其增殖、分化、分泌细胞因子等生物学能力也相应下降[10]。结核性胸膜炎是一种依赖于T细胞的免疫反应，当机体免疫水平下降时，在结核抗原刺激下不能产生有效免疫应答，因此随着年龄的增长，淋巴细胞对抗原的应答能力下降是导致T-SPOT.TB灵敏度受损的主要原因。

本研究显示，外周血淋巴细胞数量也与T-SPOT.TB的假阴性有关。一般来讲，淋巴细胞的数量可反映机体的免疫能力，当淋巴细胞总数减少时，产生的细胞因子也相应减少，机体的免疫效力降低，在一定程度上对多种疾病的诊疗和预后有较好的提示意义。当结核杆菌感染机体时，经抗原提呈细胞处理后MTB致敏T淋巴细胞，T淋巴细胞快速增殖、分化，成为发挥功能的效应性T细胞，因此淋巴细胞数，尤其是T淋巴细胞的数量和功能均有可能成为T-SPOT.TB的检测结果的影响因素。T-SPOT.TB检查时统一将送检样本中单个核细胞数量进行标化处理，调整为标准细胞浓度，一定程度上纠正了细胞数量对检验结果的影响。然而研究显示，结核性胸膜炎患者外周血淋巴细胞数量越多，发生假阴性的比例越小，T淋巴细胞的数量变化在此过程的意义仍需进一步分析完 善。

临床工作中，对胸腔积液患者，常行胸腔抽液检查，抽取胸水后，结核性胸膜炎患者再行T-SPOT.TB检查的假阴性率会升高，差异有显著统计学意义。在结核性胸膜炎中，机体的免疫细胞受感染局部细胞因子的趋化作用在胸腔聚集，胸腔积液中的单个核细胞数量较外周血单个核细胞（PBMC）显著增多，抗原特异性T细胞的数量可能达到PBMC中的15倍[11-12]。推测抽取胸腔积液后，在局部病灶的刺激下机体会再次分泌胸腔积液，抗原特异性T细胞继续向胸膜腔迁移加剧外周血抗原特异性细胞比例失调。如前所述，T-SPOT.TB检测的是体外分泌γ干扰素的抗原特异性效应T淋巴细胞，当外周血的效应T细胞减少时，一定程度上会影响T-SPOT.TB的敏感性。有报道多种浆膜腔积液（如肺泡灌洗液、腹水等）中也有类似表现，即感染局部的T细胞数量显著高于外周血[13-14]。这可能解释了当患者合并多浆膜腔积液时容易出现假阴性的原因。T-SPOT.TB假阴性组中，大部分患者合并的肺外结核为多浆膜腔积液，仅有1例肠结核患者，仔细分析发现该患者存在中重度营养不良，初步推测T-SPOT.TB假阴性可能与营养不良引起免疫受损有关。而当患者抗结核治疗后，体内的MTB逐渐被清除，而结核抗原特异性效应T细胞随之减少甚至消失，因此均有可能出现T-SPOT.TB的假阴性结果[15]。此外，Lee等[6]也发现T-SPOT.TB阳性结果与外周血抗原载体数量密切相关 。

本研究在单因素分析中发现，胸腔积液中淋巴细胞比例在两组患者之间具有显著差异，由于部分患者就诊时已经出现了胸膜粘连或者胸水很少，通过胸腔镜病理诊断而明确，无胸腔积液检验结果，为提高统计效能，因此没有进一步进行多因素回归分析，期待在更大样本中进行观察分析。两组中胸腔积液ADA无统计学差异可能也与样本数较少有关。

综上分析，结核性胸膜炎患者中高龄、外周血淋巴细胞数量减少、胸腔抽液检查、多部位肺外结核、抗结核治疗会导致T-SPOT.TB试验假阴性概率升高，可能与机体的免疫功能下降和外周血中效应T淋巴细胞减少有关。提示在临床工作中需要慎重对待T-SPOT.TB阴性结果，尤其遇到高龄、外周血淋巴细胞减少症、多部位肺外结核、T-SPOT.TB检查前给予胸腔抽液检查和抗结核治疗期间的结核性胸膜炎患者。