广东黄酒中氨基甲酸乙酯的研究进展

曹 甜，刘晓艳，白卫东，钱 敏，刘功良，刘 露，阙慕仪

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东广州 510225）

我国有着世界上最早的酿酒文化，黄酒更是作为民族代表酒而闻名于世，中国黄酒风味独特、甘醇爽口，且有着丰富的营养，广东一带的妇女在月子期间常用黄酒煮鸡肉来滋补身体，深受客家人的喜爱。但广东客家娘酒中存在着有害物质氨基甲酸乙酯（EC）[1]，它是一种2A级的致癌物[2]，对人体健康有着潜在危害，俗话说食以安为先，可见控制黄酒中EC的含量，对黄酒产业的发展具有重大意义[3]。

1 氨基甲酸乙酯介绍及其致癌性

氨基甲酸乙酯，简称EC，是一种无色的结晶[4]，易溶于水、乙醇、乙醚等[5]，结构如下：

在很多发酵食品中酒类、酱油等中EC都存在[6]。关于EC的致癌性很早就有研究了[7]。

1.1 EC的致癌机理

很多研究学者都关注并探究了EC的致癌机理[8]。EC很容易被人体吸收，会引起皮肤癌、肝癌等，因此对人体健康不利。EC在生物体内基本上是在肝内发生分解代谢或是以尿的形式排出，但仍然有微量的EC能被氧化为一种环氧化物，此环氧化物会在体内形成DNA的加聚物，破坏生物体DNA双链结构，导致代谢的细胞癌变；或是EC被细胞色素氧化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，此物质通过诱导Cu2+调控而导致DNA损伤[9]。

1.2 EC的生成机理

相关研究表明，EC的生成机理与黄酒的发酵原理相关，不同的发酵方式产生不同的机理[10]，在黄酒中EC的生成最主要的是尿素与乙醇反应[11]，其次是氨甲酰磷酸与乙醇反应、瓜氨酸与乙醇反应。相关学者证实了黄酒中EC的产生基本上都是由乙醇和尿素反应生成的，在黄酒的酿造过程中，原辅料带入或是在发酵过程中酵母菌代谢产生的尿素都会造成尿素的积累[12]。

2 氨基甲酸乙酯的检测方法

EC的检测方法比较多，从早期开始就有研究，不过研究方法并不成熟，只能定性检测，随着仪器的发展，EC的检测方法也越来越完善，目前关于EC的检测使用较多的方法是气质联用技术[13]。

2.1 气相色谱法

气相色谱法在早期应用广泛，多用于气体、易挥发的液体和某些固体的分析中[14]，而且灵敏度高，可用于测定痕量物质，一般mg级的都能检测到，分析速度快，一般在1 h内就能完成一次分析，且操作迅速又简单。但气相色谱法难以定性，且只能用于复杂组分的检测，若没有标准品的色谱图对照，则很难判定某出峰时间的色谱峰代表什么物质。

2.2 气质联用法

GC-MS在气相色谱法的基础上能快速高效地对样品进行定量和定性分析[15]。特别适用于复杂混合物中某组分的鉴定[16]。一般黄酒中的EC检测采用此法，刘俊等人[17]使用气质联用法测定了黄酒中微量EC的含量。研究表明，此方法线性相关系数0.993 9，回收率为94.65%。

样品的GC-MC萃取前处理一般采用液液萃取、固相萃取或顶空固相微萃取等方法将EC提取出来，再进行下一步操作。

（1）液液萃取。液液萃取是早期常用的一种样品前处理方法，利用了溶解度差异来分离组分，一般需使用大量的有机溶剂才能达到目的。对于萃取EC的很多试剂都具有一定的毒性，早期一些学者使用三氯甲烷、无水乙醚等，但由于毒性很强，对人体健康有危害，后来采用CH2Cl2作为溶剂去提取EC，提取效果好，且毒性相对较低，同时对环境的危害小。林超等人[18]采用液液萃取结合GC-MS内标法测定葡萄酒中EC的含量，以氨基甲酸丙酯为内标物，探究了KC 1的质量分数、CH2Cl2的用量、待测溶液的pH值等因素对EC萃取率的影响，得出在样品pH值保持不变的情况下，KC 1质量分数为40%，CH2Cl2用量为300 mL时，方法的检出限为8 μg/L，回收率为90.7%～106.3%。

（2）固相萃取。萃取柱内的吸附剂吸附样品中的目标成分，而其他成分则通过其他试剂洗脱下来，达到样品分离纯化的目的。李凤华等人[19]将样品经硅藻土固相萃取柱净化，后采用乙醚洗脱，得出EC在10～160 g/L质量浓度范围内线性关系良好，最低检出浓度为4 g/L，回收率为93.3%～111.8%。与早期的LLE样品前处理方法相比，SPE方法所需的萃取试剂大大减少了，而且萃取率更好。

（3）固液萃取。固液萃取，也叫浸提，使固体样品中可溶性成分溶解于溶剂中而加以分离的方法。项东方等人[20]将样品和硅藻土混合均勾，装入玻璃色谱层析柱中，然后用萃取溶剂洗脱得出EC的检出限为2.0 μg/L，回收率91.0%～102.0%。此方法与固相萃取相似，具有较高的准确度，萃取柱需要自己制作，不过这样精密度也更高些。

（4）固相微萃取。固相微萃取一般是将固相微萃取头纤维暴露于密封的样品瓶的顶空中，样品经过加热后，其中的挥发性气体部分进入气相色谱仪分析的方法[21]。刘俊[22]采用固相微萃取萃取EC，丙酸辛酯为内标物，将样品置于50℃条件下进行预热，5 min后进行萃取45 min，最后解析5 min，黄酒中EC含量能最大程度地降低。这种方法极为简化、分析速度快，避免了高沸点物或非挥发性物质对分析柱造成超载和污染问题。

2.3 气相色谱-串联质谱法

对于分析复杂样品中的微量EC时，GC-MS法也有一定的局限性，因为一般样品经过前处理后，其所含的EC或多或少都会减少，对检测结果产生干扰。有研究者探究过GC-MS和GC-MS-MS对酒的测定比较，发现GC-MS-MS法可以除去GC-MS法中的干扰峰，且可以省去样品前处理的步骤，更加灵敏、快速。

2.4 液质色谱法

液相色谱-质谱联用（LC-MS） 能用于热稳定性差、难挥发的大分子有机化合物的检测，此方法发展时间不长，对样品的检测有着高选择性，在酒类检测中使用的较少，多用于酱油生产中。

3 吸附氨基甲酸乙酯的材料探究

研究表明，黄酒中EC的直接减除与多种材料有关，如活性炭、硅胶、硅藻土、壳聚糖、PVPP等，其中活性炭与壳聚糖的吸附效果较好，但用活性炭吸附后对黄酒的感官影响也较大，吸附后酒变为浅黄色，且酒味较淡；使用壳聚糖吸附对酒体的风味影响不大，但壳聚糖溶解度差，且价格较高；硅胶、硅藻土和PVPP这3种材料吸附效果基本一致，且较低，其中用硅藻土吸附黄酒中的EC后酒体风味也能最大程度地保持，故在黄酒中使用较多，且符合经济效益。

硅藻土的主要成分是二氧化硅，轻质多孔、比表面积大、化学稳定性高，之所以具有吸附性能主要原因是硅藻土的壳壁由非晶质二氧化硅构成，壳壁表面具有特殊的微孔结构，这些小孔能均匀吸附各种有机和无机物质。运用于食品行业作为助滤剂是优质硅藻土的主要用途之一，我国饮料产业中硅藻土的用量达到其产量的2/3。此外，硅藻土还可以用于吸附净化等产业，可用于吸附各种金属离子、有机化合物和高分子聚合物等。这主要是由于其表面羟基结构的独特性。硅藻土表面羟基结构使其颗粒表面带负电荷，在水溶液中呈弱酸性，因此可用于吸附阳离子。我国硅藻土矿产资源丰富，价格低廉，应用潜力巨大。但是硅藻土产地不同，吸附性能差异很大，且天然硅藻土往往因杂质含量较高，而使得其应用在许多方面受到限制。这主要是由于杂质会造成微孔堵塞，且会占据硅藻土吸附点位，从而造成硅藻土吸附效果的降低。因此，需要通过提纯改性等手段进一步提高其吸附性能。随着技术的迅速发展，越来越多性能优良的新型吸附性高分子材料被合成，并在许多行业中广泛应用。在黄酒产业中硅藻土的改性已经较为普遍，仲恺农业工程学院白卫东经过研究碱浸硅藻土对黄酒中EC的去除，发现经过碱处理后的硅藻土其去除率提升很高，且处理后酒体的风味与原酒基本一致。

为了能在客家黄酒工厂化生产中，用更好的吸附技术去除氨基甲酸乙酯，试验对比分析5种吸附材料，从中挑选出最优改性材料和对应的最优单因素组合预处理方案。结果表明，5种原始吸附材料对广东客家黄酒中氨基甲酸乙酯的去除率依次为硅藻土33.24%，壳聚糖60.89%，交联聚乙烯基吡咯烷酮24.30%，活性炭52.33%，硅胶25.43%。综合以上结果得出壳聚糖的吸附效果最好，但价格较高，硅藻土综合有优势，故探究了关于硅藻土不同的改性方法，利用碱法改性硅藻土和壳聚糖改性硅藻土，探索其最适改性条件。利用单因素优化试验，从时间、温度、用量3个单因素出发，并通过正交试验对预处理条件进一步优化。试验结果表明，经过碱法改性过的硅藻土加入到黄酒中，吸附去除EC的最优条件为反应温度25℃，反应时间13 h，硅藻土添加量1%。通过试验所得的改性硅藻土在最优处理条件下，氨基甲酸乙酯去除率最大可达78.92%，而未经改性的硅藻土对EC的去除率仅为34.53%。而用壳聚糖改性硅藻土后，加入黄酒中进行吸附，经试验筛所得改性硅藻土，吸附效果为原硅藻土的2.24倍，此次试验所得改性硅藻土材料对黄酒中EC的吸附去除的最优条件为反应温度25℃，反应时间11 h，硅藻土添加量1.2%，得到最佳去除效果为74.74%。

4 结语

随着社会的发展，人们对食品安全的关注度越来越高，黄酒中的EC去除一直是个亟待解决的问题，而且黄酒在国际上的关注也较高，特别是中国黄酒在日本、东南亚有广泛市场，深受当地人们喜爱，因此解决EC问题的需求也越来越紧迫，应积极采取有效措施，控制黄酒中的EC含量，维护黄酒消费市场稳定，尽早为我国黄酒生产消除隐患。