豚鼠耳蜗Corti器铺片方法改进与免疫荧光染色比较研究

方舒 胡一勇 吕萍 于宁

1川北医学院附属医院耳鼻咽喉科(南充637000)

2解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉研究所（北京100853）

耳蜗基底膜免疫荧光染色铺片是一种利用荧光显微镜对基底膜组织或细胞上与荧光素特异性结合的目标抗原进行直观、准确的显像定位的形态学研究方法，在耳科学生理及病理研究领域中广泛应用[1-3]。常规豚鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色铺片方法步骤繁多，耗时较长，本实验室统计数据表明每一个耳蜗标本的平均处理时间在30小时以上[4-6]。为提高实验效率本文拟在常用耳蜗基底膜铺片染色方法的基础上探索可以简略或改进的步聚，并利用激光共聚焦显微镜观察对比改进前后的染色效果，旨在建立一种新的快速、有效、可靠的基底膜铺片染色方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1）Dunkin Hartley豚鼠15只，体重250-280g，雌雄不限，购自北京市科宇动物养殖中心。实验豚鼠右耳为对照组（A组），作常规耳蜗基底膜免疫荧光染色铺片；左耳为实验组（B组），作快速耳蜗基底膜免疫荧光染色铺片。

2)实验试剂：1%戊巴比妥钠溶液、4%多聚甲醛（PFA）溶 液 、0.01M PBS、Triton X-100(sigma,9002-93-1)，BSA（sigma,9048-46-8）、封闭用山羊血清(碧云天,C0265)、Rabbit Anti-Myosin Ⅶa primary antibody（abcam,ab3481）、Rabbit anti-neurofilament primary antibody（abcam,ab8135）、Alexa-568 phalloidin（invitrogen,A12308）、Goat anti rabbit alexa-488 antibody(invitreogen,A-11034)、DAPI染色液（碧云天,C1006）、mounting solution（invitrogen,P36930）等。

3)实验器械：2.5ml无菌注射器、组织剪、眼科剪、培养皿、3ml塑料滴管、显微镊（Dumont 0295-po、0508-po）、吸水纸、EP管、体视显微镜、Leica TCS SP8等。

1.2 方法

1.2.1 耳蜗取材固定

腹腔注射过量1%戊巴比妥钠处死豚鼠，迅速断头取出双侧听泡；自骨性外耳道入口开放听泡，去除耳蜗周围骨质，充分暴露耳蜗后将其置于盛有4%多聚甲醛的培养皿中；在体视显微镜下用显微镊于蜗顶钻孔，开放圆窗，再轻轻将镫骨推入卵圆窗。吸取4%多聚甲醛自蜗尖灌入，可见淋巴液自卵圆窗及圆窗流出，重复灌流3-4次；实验组耳蜗立即在盛有4%多聚甲醛的培养皿行基底膜剥离，对照组耳蜗浸泡于4%多聚甲醛的EP管内4℃过夜（16h）保存，再转移至盛放PBS的玻璃皿中行基底膜剥离。

1.2.2 耳蜗基底膜剥离

修剪耳蜗周围骨质，充分暴露耳蜗，用显微镊自蜗尖至蜗底去除耳蜗中耳腔面的骨质，显露螺旋韧带；第二回的岩部骨质较厚，将眼科剪小心插入鼓阶，一点一点剪去除岩部骨质；骨质剥除干净后，自顶回起用显微镊分离耳蜗螺旋韧带与基底膜，完全暴露宝塔状蜗轴及附着于其上的基底膜；小心撕去前庭膜及盖膜，按蜗尖向蜗底的顺序将基底膜自蜗轴上分离。

1.2.3 常规豚鼠耳蜗基底膜染色

剥离的基底膜用PBS快速漂洗三遍；置于含有通透液（0.25%Triton X-100）的EP管内30分钟；吸去通透液，加入封闭液（由10%山羊血清、1%BSA及PBS配制而成），室温下放置30分钟；加入用封闭液稀释的一抗（兔抗NF 1:800或兔抗MyosinⅦa 1:500），4℃过夜（16h）孵育；吸出管内一抗，PBS漂洗四遍，每次15min；吸出管内PBS，加入用封闭液稀释的二抗（ALEXA 488 1:600、phalloidin 1:1000），37℃避光孵育45分钟；按洗涤一抗的方式洗涤二抗；加入DAPI染色液避光静置15min，PBS漂洗三遍，每次5分钟。

1.2.4 快速豚鼠耳蜗基底膜染色

剥离的基底膜用PBS快速漂洗三遍；置于含通透-封闭液（由0.25%Triton X-100、10%山羊血清、1%BSA及PBS配制而成）的EP管内30分钟；加入用封闭液稀释的一抗（一抗种类及浓度同常规方法），室温下孵育2小时；吸出管内一抗，PBS快速漂洗3遍，管内加入PBS置摇床上漂洗10分钟，再用PBS快速漂洗3遍；吸出管内PBS，加入用封闭液稀释的二抗（二抗种类及浓度同常规方法），室温避光孵育1小时；按洗涤一抗方式洗涤二抗；加入DAPI染色液避光静置15min，PBS漂洗三遍，每次5分钟。

表1 两种方法用时比较Table 1 Time-consuming comparison of the two methods

1.2.5 基底膜铺片

将染色完毕的基底膜铺片用滴管转移至盛放PBS的玻璃皿内，以圆窗龛上缘最高点向蜗顶作假想直线，将基底膜分为钩端、1-4回共5段；用滴管将基底膜转移至清洁载玻片上，吸净组织周围液体，并在其上加一滴mounting solution，体视显微镜下观察调整标本，使其正面朝上，铺放平整后封片。

1.2.6 激光共聚焦显微镜观察及图像采集

每张基底膜免疫荧光染色铺片均在Leica SP8激光共聚焦荧光显微镜在20X、40X、63X下观察Corti器上荧光蛋白标记的神经丝蛋白或内外毛细胞肌球蛋白的表达情况并采集图像。

2 结果

对照组耗时37.5小时，实验组耗时5.25h（表1），对照组清晰显示由ALEX-488标记的神经丝蛋白或内外毛细胞肌球蛋白、DAPI标记的细胞胞核、phalloidin标记的微丝蛋白（Figure1 A1-A4），实验组亦可清晰显示荧光素标记的内外毛细胞肌球蛋白或神经丝蛋白、细胞核、微丝蛋白（Figure1 B1-B4），两者在共聚焦显微扫描图像成像质量上无明显差异。

图1 对照组（A1-A4）及实验组(B1-B4)代表性共聚焦图片。A1,A2,B1,B2中绿色为兔抗myosin联合羊抗兔Ⅶa Alexa 488联合标记的毛细胞，A3,A4,B3,B4中绿色为兔抗neurofilament联合羊抗兔Ⅶa Alexa 488标记的神经纤维,红色为phalloidin联合Alexa 568标记的毛细胞纤毛及表皮板，蓝色为DAPI标记的细胞核。两组成像效果未见明显差异。Fig.1 Representative confocal photomicrographs of control(A1-A4)and experimental(B1-B4)group.Hair cells in A1,A2,B1,and B2 are labeled with a rabbit anti-myosinⅦa primary antibody combined with a goat anti-rabbit Alexa 488-conjugated secondary antibody（green）.Nerve fibers in A3,A4,B3,and B4 are labeled with a rabbit anti-neurofilament primary antibody combined with a goat anti-rabbit Alexa 488-conjugated secondary antibody（green）.The stereocilia and cuticular plate of the hair cells are labeled with 568-conjugated phalloidin(red),DAPI(blue)labels all nuclei.There was no significant difference in image quality between the control and experimental group.

3 讨论

耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色法是耳蜗基底膜铺片技术及免疫荧光染色技术的联合应用，主要步骤包括取材、固定、剥离、免疫荧光染色及铺片[7]。本实验通过减少组织固定、免疫荧光染色一抗孵育及抗体洗涤时间对常规方法进行改进，提高了豚鼠耳蜗基底膜Corti器免疫荧光染色铺片的实验效率。

目前国内外报道多采用将离体耳蜗浸泡在4%多聚甲醛中4℃过夜进行组织固定，有研究发现长时间使用多聚甲醛固定组织会损失组织细胞某些成分的抗原性[8,9]。Scott等认为使用不含甲醇的4%多聚甲醛在室温下对耳蜗组织固定3-4小时既能达到良好的固定效果，又不会干扰目前听觉研究领域使用的绝大多数一抗[10]。本实验直接将离体耳蜗在盛有4%多聚甲醛的培养皿中进行灌流及基底膜剥离，大大缩短了实验时间，并减少多聚甲醛对一抗的干扰，结果显示相较于对照组4%多聚甲醛4℃过夜组织固定，实验组标本固定效果良好，未见明显荧光干扰。

除外为抗原-抗体反应提供适宜环境条件外，研究人员还通常采用使用通透剂破膜及延长一抗孵育时间达到使抗体与抗原充分结合的目的，常规的组织通透多与封闭同时进行。耳科学研究领域中常规的一抗孵育时间从1-48小时不等[11-14]，本实验采用常温2小时孵育NF、myosin，荧光染色结果未见明显差异，相较于对照组4℃过夜孵育这样的改进能够大大缩短实验时间。

洗涤是免疫荧光染色重要环节，良好的洗涤能减少非特异性染色，目前常规的漂洗方法为PBS洗涤3-4遍，每次5-15分钟不等，本实验采用PBS快洗3遍、再将组织浸泡在PBS液中置摇床上10分钟后，PBS洗3遍的漂洗方法，通过增加漂洗次数达到缩短总洗涤时间的目的，结果显示与对照组PBS洗涤4×15分钟相比，两组均未见明显背景荧光。

本实验结果显示豚鼠耳蜗基底膜铺片快速荧光染色法可以在保证实验结果的基础上有效的提高实验效率。因此，该法值得在耳科研究领域尤其是形态学研究方面推广。