耐多药肺结核患者基线菌株二线抗结核药物耐药情况分析

何贵清 施伎蝉 吴联朋 蒋贤高

[摘要] 目的 了解耐多药肺结核患者基线菌株对二线抗结核药物的耐药情况。 方法 随机选取从2016年3月～2017年5间本院收集的耐多药肺结核患者的基线52株，对其进行9种二线抗结核药物的敏感性进行试验，分析对不同药物耐药比例以及同类药物交叉耐药情况。 结果 9种二线抗结核药物中，耐药比例顺位依次为氧氟沙星=左氧氟沙星（均占59.6%，31/52）>莫西沙星（占30.8%，16/52）>阿米卡星=卡那霉素（均占9.6%，5/52）>对氨基水杨酸=环丝氨酸（均占7.7%，4/52）>卷曲霉素=丙硫异烟胺（均占5.8%，3/52）。氧氟沙星和左氧氟沙星呈完全交叉耐药，与莫西沙星交叉耐药比例占51.6%（15/31）；阿米卡星和卡那霉素呈完全交叉耐药，与卷曲霉素交叉耐药占60%。 结论 耐多药肺结核患者基线菌株对氟喹诺酮类药物耐药严重，其他二线抗结核药物亦存在不同程度耐药。因此，在制定起始有效耐多药结核治疗方案前应完善二线药物敏感性试验。

[关键词] 分枝杆菌；结核；二线药物；药物敏感性试验；耐多药结核

[中图分类号] R521 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）15-0084-04

Analysis of drug resistance of second-line anti-TB drugs to baseline strain in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis

HE Guiqing1 SHI Jichan1 WU Lianpeng2 JIANG Xiangao1

1.Department of Infectious Diseases，Wenzhou City Central Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China； 2.Department of Laboratory，Wenzhou City Central Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the resistance of second-line anti-TB drugs to baseline strain in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis. Methods A total of 52 baseline strains in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis collected from March 2016 to May 2017 in our hospital were randomly selected. The sensitivity of the nine kinds of second-line anti-TB drugs was tested， to analyze the proportion of different drug resistance and cross-resistance of similar drugs. Results Among the 9 second-line anti-TB drugs， the ratio of drug resistance was ofloxacin=levofloxacin（59.6%， 31/52）>moxifloxacin（30.8%， 16/52）> amikacin=kanamycin（both 9.6%， 5/52）>p-aminosalicylic acid=cycloserine（both 7.7%， 4/52）> capreomycin =prothionamide（both 9.6%，3/52）. Ofloxacin was completely cross-resistant with levofloxacin， and its cross-resistant rate with moxifloxacin accounted for 51.6%（15/31）. Amikacin was completely cross-resistant with kanamycin， and its cross-resistant rate with capreomycin accounted for 60%. Conclusion The baseline strains of patients with multi-drug resistant pulmonary tuberculosis are seriously resistant to fluoroquinolones. There is resistance to some extent for other second-line anti-tuberculosis drugs. Therefore， second-line drug susceptibility testing should be completed prior to establishing an effective MDR-TB treatment regimen.

[Key words] Mycobacterium； Tuberculosis； Second-line drugs； Drug susceptibility testing； Multidrug-resistant tuberculosis

全球耐多藥结核病形式严峻，疗程长，需联合4～5种药物，不良反应大，传统WHO推荐长疗程方案至少大于20个月，导致患者难以坚持，在真实世界里，治疗成功率不足50%，提示缩短疗程势在必行。值得可喜的是孟加拉等国短程治疗方案治疗成功率显著高于传统长疗程方案[1-3]，促使2016 WHO制定了耐多药结核病短程方案并向全世界推广[4]，但由于是非随机对照研究，询证学依据尚不充分。特别国内耐多药结核病基线菌株的Pre-XDR和XDR-TB比例较高[5-6]，当前盲目推广短程方案未必可行，可能因治疗不充分势必造成更多药物耐药，需及时完善二线抗结核药物敏感性试验制定合理方案。国内耐多药结核病二线耐药情况因地区不同而异。因此，本研究随机抽取温州市中心医院2016年3月～2017年5月期间保种的耐多药肺结核患者基线菌株52株，对其进行9种二线抗结核药物敏感性试验并分析，以了解我院收治耐多药肺结核基线菌株9种二线抗结核药物的耐药情况，为制定有效的起始抗耐多药结核方案提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

菌株来源温州市中心医院收集的MDRTB肺结核患者的基线菌株，随机抽取2016年3月～2017年5月期间保种的基线菌株52株经罗氏培养基复苏传代。标准株H37Rv菌株来自浙江省结核病参比实验室。1.2 主要试剂

罗氏培养基及分枝桿菌药敏罗氏培养管均购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 罗氏比例法药敏试验

罗氏比例法药敏试验具体操作参考文献[7]进行。罗氏比例法药敏试验的9种二线抗结核药物，具体浓度如下：氧氟沙星（Ofx）：2.0 μg/mL；左氧氟沙星（Lfx）：2.0 μg/mL；莫西沙星（Mfx）：2.0 μg/mL；阿米卡星（Ak）：30.0 μg/mL；卡那霉素（Km）：30.0 μg/mL；卷曲霉素（Cm）：40.0 μg/mL；丙硫异烟胺（Pto）：40 μg/mL；环丝氨酸（Cs）：40.0 μg/mL；对氨基水杨酸（PAS）：1.0 μg/mL。每批药敏试验以标准株H37Rv作为敏感对照组。受试菌株的药物敏感性结果判断标准如下：

耐药百分比=含药培养基菌落数/对照培养基上菌落数×100%；如果耐药百分比< 1%者报告敏感（S）；如果耐药百分比≥1%者报告耐药（R）。

2 结果

2.1 9种二线抗结核药物耐药情况

在52株耐多药结核分枝杆菌菌株中，对9种抗结核药物全敏感有19株（占36.5%），任一耐药的抗结核药物顺位依次为Ofx=Lfx（均占59.6%，31/52）>Mfx（占30.8%，16/52）>AK=Km（均占9.6%，5/52）>PAS=Cs（均占7.7%，4/52）>Cm=Pto（均占5.8%，3/52）。见表1。

2.2 二线抗结核药物交叉耐药情况

Ofx和Lfx完全交叉耐药，耐药Ofx/Lfx 31株中，有16株同时耐Mfx（即Ofx/Lfx与Mfx交叉耐药占51.6%）。Ak和Km完全交叉耐药，耐Ak/Km 5株中，有3株同时耐Mfx（即Ak/Km与Cm交叉耐药占60.0%）。见表2。

3 讨论

目前WHO推荐的MDR-TB标准化方案能够治愈相对部分患者，如起始组成方案包含无效药物可能会降低治愈率[7-8]，不仅使患者遭受不必要的药物毒副作用，而且增加耐药性[9]。研究报道，MDR-TB方案中两类核心药物，如氟喹诺酮类药物耐药后，治疗成功率降低[10-11]，而二线针剂类药物耐药与预后亦有相关性[12]。唯一有效预防因起始治疗无效或不充分的方法就是及时检测二线抗结核药物的敏感性，以制定个体化治疗方案。因此，本次研究随机选取52株耐多药肺结核患者的基线菌株检测9种二线药物敏感性试验，了解本院MDR-TB基线菌株的二线抗结核药物的耐药性。本院是温州市耐多药结核病定点医院，收治全市的耐多药结核病患者，但本次研究并未全部纳入2016年3月～2017年5月全部基线菌株进行检测分析，而且样本量较小，存在一定抽样偏倚，虽不能代表本地区的耐药流行情况，但在某种程度上本研究结果表明，耐多药肺结核患者基线菌株对二线抗结核药物存在的不同程度耐药需引起临床医生、尤其是肺科医生的重视。

本研究发现耐氟喹诺酮类药物较严重，与上海某医院报道的耐多药结核菌株对氟喹诺酮类药物耐药较接近[6]，特别是Ofx和Lfx耐药比例较高，而且与Mfx超过1/2呈交叉耐药，氟喹诺酮耐药情况可能与院外该类药物不合理使用有关[13-14]。浙江省流调发现2013年MDR-TB菌株耐Ofx达27.7%[15]。因此，对于耐多药肺结核患者，在没有二线药敏结果情况下，选择喹诺酮类药物应慎重，尤其尽量避免使用低代氟喹诺酮类药物，如氧氟沙星和左氧氟沙星。而对于低代氟喹诺酮类药物耐药的患者，选择Mfx能改善Mfx敏感株的耐多药结核病患者的预后[16]。WHO指出，氟喹诺酮类为耐多药结核方案的核心药物，列为A组用药，能显著改善单利福平耐药结核及耐多药结核患者的疗效，如无禁忌证，必须纳入治疗方案[4]。对氟喹诺酮类药物的耐药是MDR-TB向XDR-TB进展的耐药主要形式。因此，耐多药肺结核患者起始治疗不充分可能会导致最终治疗失败，诱发更多药物耐药，如XDR-TB或全耐药，增加传播耐药的高风险。二线注射类药物（Ak， Km和Cm）是耐多药结核病化疗方案中同样起着举足轻重的作用，WHO列为B组用药，可增加耐多药结核患者治疗的成功率，因此，无禁忌证，同样必须纳入方案[4]。本研究发现，二线注射类药物耐药比例相对较低，浙江省2013年二线针剂耐药比例为8.5%，与其报道相接近[15]，提示耐多药结核对二线针剂药物敏感性可能较好，尤其Cm耐药比例更低，在Ak/Km耐药后，部分患者可继续选择Cm仍然有效。本次研究中的其他二线口服抗结核药物如PAS、Cs和Pto耐药比例相对较低，赵冰等[5]从全国2007～2008年耐药基线调查收集的菌株中选取2008年4～7月期间的126株MDR-TB菌株进行二线药敏试验发现PAS和Pto耐药比例均为3.2%，而Cs为13.5%；而浙江省流调结果显示2013年MDR-TB菌株的PAS 和Cs耐药比例分别为14.9%和10.6%[5，15]。故制定起始治疗方案时二线药物敏感试验尤为重要。

目前绝大多数有资格开展一线抗结核药敏试验的结核病实验室，二线抗结核药物敏感试验并非常规开展，而是等待一线药敏结果回报利福平和异烟肼耐药后再继续检测二线药敏，而部分患者因失访而未继续检测二线药敏。因此，相当部分患者在等待二线药敏结果期间很有可能因起始方案无效导致耐药传播，或因治疗方案不充分发生进一步获得耐药而增加耐药传播[17]。表型药敏虽然准确，但需要等待较久时间[18]，无法早期制定起始有效治疗方案。因此2016年WHO推荐快速二线分子药敏线性探针GenoType MTBDRsl以指导个体化治疗[19]。高谦教授团队对治疗过程中的患者体内结核菌的耐药微进化进行了深入研究发现，“有效”治疗组和“非有效”治疗组多药联用下患者体内结核菌发生截然相反的耐药微进化动态变化：即前者阻止了耐药性获得；而后者则发生耐药突变的积累与富集[20]。该项研究结果提示迫切需要及时、准确的药敏结果以制定起始有效的治疗方案，对于提高治愈率、减少耐药产生具有十分重要的意义。

总之，通过本次研究，发现耐多药肺结核基线菌株对氟喹诺酮类药物高度耐药，尽管Mfx耐药比例低于Ofx和Lfx，但仍存在较高交叉耐药性，尤其缺乏二线抗结核药物敏感性检测结果时，起始选择氟喹诺酮类药物需谨慎。本研究发现耐多药结核菌株对二线针剂类敏感性相对较好，可优先选择。其他二线口服抗结核药物亦存在不同程度耐药。因此，耐多药结核病患者在起始组成有效方案时，应完善二线抗结核药物敏感性试验，特别是快速二线分子药敏检测开展，可缩短检测等待时间，达到精准快速有效治疗，提高治愈率，减少耐药发生及其耐药的传播。

[参考文献]

[1] Aung J，Van Deun A，Declercq E，et al. Successful 9-month Bangladesh regimen' for multidrug-resistant tuberculosis among over 500 consecutive patients[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2014，18（10）：1180-1187.

[2] Kuaban C，Noeske J，Rieder HL，et al. High effectiveness of a 12-month regimen for MDR-TB patients in Cameroon[J].Int J Tuberc Lung Dis，2015，19（5）：517-524.

[3] WHO. Global Tuberculosis Report 2017[Internet]. Geneva：World Health Organization，http：//www.who.int/tb/publications/global report/en，2017-11-12.

[4] WHO. WHO Treatment guidelines for drug-resistant tuberculosis，2016 Update[Internet]. Geneva：World Health Organization，http：//www.who.int/tb/areas-of-work/drug-resistant-tb/treatment/resources/en，2017-11-12.

[5] 趙冰，宋媛媛，逄宇，等.中国耐多药结核分枝杆菌二线抗结核药物敏感性分析[J]. 中国防痨杂志，2013，35（10）：831-834.

[6] 刘一典，桂徐蔚，景玲杰，等. 耐多药结核分枝杆菌临床分离株30株对氟喹诺酮类及二线注射类抗结核药敏感性的分析[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2013， 4（7）：1565-1568.

[7] 赵雁林，逢宁. 结核病实验室检验规程[M]. 北京：人民卫生出版社，2015：59-65.

[8] Falzon D，Gandhi N，Migliori GB，et al. Resistance to fluoroquinolones and second-line injectable drugs：Impact on multidrug-resistant TB outcomes[J]. Eur Respir J，2013，42：156-168.

[9] Cegielski JP，Kurbatova E，van der Walt M，et al. Multidrug-resistant tuberculosis treatment outcomes in relation to treatment and initial versus acquired second line drug resistance[J]. Clin Infect Dis，2016，62：418-430.

[10] Alene KA，Yi H，Viney K，et al. Treatment outcomes of patients with multidrug-resistant and extensively drug resistant tuberculosis in Hunan province，China[J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：573.

[11] Farhat MR，Jacobson KR，Franke MF，et al. Fluoroquinolone resistance mutation detection is equivalent to culture-based drug sensitivity testing for predicting multidrug-resistant tuberculosis treatment outcome：A retrospective cohort study[J]. Clin Infect Dis，2017，65（8）：1364-1370.

[12] Oliveira O，Gaio R，Villar M，et al. Predictors of treatment outcome in multidrug-resistant tuberculosis in Portugal[J]. Eur Respir J，2013，42（6）：1747-1749.

[13] Dooley KE，Golub J，Goes FS，et al. Empiric treatment of community-acquired pneumonia with ？覲uoroquinolones，and delays in the treatment of tuberculosis[J]. Clinical Infectious Diseases，2002，34（12）：1607-1612.

[14] Devasia RA，Blackman A，Gebretsadik T，et al. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis：The effect of duration and timing of ？覲uoroquinolone exposure[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2009，180（4）：365-370.

[15] Wu B，Zhang L，Liu Z，et al. Drug-resistant tuberculosis in Zhejiang Province，China：An updated analysis of time trends，1999-2013[J]. Glob Health Action，2017，10（1）：1293925.

[16] Chien JY，Chien ST，Chiu WY，et al. Moxifloxacin improves treatment outcomes in patients with ofloxacin-resistant multidrug-resistant tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother，2016，60 （8）：4708-4716.

[17] Kempker RR，Kipiani M，Mirtskhulava V，et al. Acquired drug resistance in mycobacterium tuberculosis and poor outcomes among patients with multidrug resistant tuberculosis[J]. Emerg Infect Dis，2015， 21（1）：992-1001.

[18] Domínguez J，Boettger EC，Cirillo D，et al. Clinical implications of molecular drug resistance testing for Mycobacterium tuberculosis：A TBNET/RESIST-TB consensus statement[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2016，20（1）：24-42.

[19] WHO. The use of molecular line probe assays for the detection of resistance to second-line anti-tuberculosis drugs：Policy Guidance[Internet]. http：//www.who.int/tb/publications/lpa-mdr-diagnostics/en， 2017-11-21.

[20] Trauner A，Liu Q，Via LE，et al. The within-host population dynamics of Mycobacterium tuberculosis vary with treatment efficacy[J]. Genome Biol，2017，18（1）：71.

（收稿日期：2018-01-27）