地西他滨抑制AML1—ETO+白血病细胞增殖和诱导凋亡的机制研究

李海英 周斌 张力 高申孟

[摘要] 目的 研究地西他濱抑制AML1-ETO+白血病细胞增殖和诱导凋亡，并初步探讨其可能的机制。 方法 Kasumi-1细胞常规培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，CCK8法检测地西他滨抑制Kasumi-1细胞增殖，流式细胞术检测Kasumi-1凋亡，Western Blot检测相关蛋白的表达，RT-PCR检测AML1-ETO和miR-193a的表达。结果 地西他滨可以抑制Kasumi-1细胞增殖，具有浓度效应和时间效应；并能诱导凋亡，对照组、24 h和48 h组细胞凋亡率分别为（5.29±0.88）%、（9.83±1.71）%和（19.47±1.84）%；地西他滨能减少AML1-ETO蛋白的表达，0.1、0.5和1 μmol/L地西他滨组与对照组的比值分别为（0.85±0.21）、（0.28±0.06）和（0.10±0.07），24、48 h组AML1-ETO蛋白与对照组的比值为（0.31±0.21）和（0.24±0.11），但不影响AML1-ETO mRNA表达，24和48 h组与对照组的比值分别为（0.96±0.19）和（0.84±0.11），统计分析无显著性差异（F=1.22，P>0.05）；地西他滨能上调miR-193a，24和48 h分别上升（3.61±0.06）和（6.99±0.74）倍，并减少MDM2和Cyclin D1蛋白的表达，MDM2和Cyclin D1蛋白加药组与对照组的比值分别为（0.51±0.19）和（0.50±0.10）。 结论 地西他滨通过上调miR-193a阻遏AML1-ETO的翻译，并减少MDM2和Cyclin D1蛋白的表达，从而抑制AML1-ETO+白血病细胞增殖和诱导凋亡。

[关键词] 地西他滨；AML1-ETO；白血病；miR-193a

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）15-0004-05

Mechanism of decitabine in inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis of AML1-ETO+ leukemia cells

LI Haiying1 ZHOU Bin1 ZHANG Li2 GAO Shenmeng1

1.Central Laboratory， Wenzhou Medical University First Affiliated Hospital， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Radiotherapy and Chemotherapy， Wenzhou Medical University First Affiliated Hospital， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To study the decitabine inhibits the proliferation and induces apoptosis of AML1-ETO+ leukemia cells and to explore its possible mechanism. Methods Kasumi-1 cells were commonly cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum. The proliferation of Kasumi-1 cells was determined by CCK8 assay. Flow cytometry was used to detect Kasumi-1 apoptosis. Related protein expression was measured by Western Blot. The expressions of AML1-ETO and miR-193a were measured by RT-PCR. Results Decitabine could inhibit the proliferation of Kasumi-1 cells with concentration effect and time effect， and could induce apoptosis. The apoptosis rates of control group， 24 hours and 48 hours group were （5.29±0.88）% and （9.83±1.71）% and （19.47±1.84）%， respectively. Decitabine could decrease the expression of AML1-ETO protein， and the AML1-ETO protein ratios of 0.1， 0.5 and 1 μmol/L decitabine group to the control group were （0.85±0.21）， （0.28±0.06） and （0.10±0.07）. The ratios of AML1-ETO protein of 24 hours group， 48 hours group to control group were （0.31±0.21） and （0.24±0.11）. But decitabin did not affect the expression of AML1-ETO mRNA， and the ratios of AML1-ETO mRNA of 24 hours group and 48 hours group to control group were （0.96±0.19） and （0.84±0.11）. The difference was not significant（F=1.22， P>0.05）. Decitabine could up-regulate the expression of miR-193a by （3.61±0.06） and （6.99±0.74） fold respectively at 24 and 48 hours， and decreased the expression of MDM2 and Cyclin D1.The protein expression ratios of MDM2 and Cyclin D1 of dosing group and control group were （0.51±0.19） and （0.50±0.10）， respectively. Conclusion Decitabine inhibits the proliferation and induces apoptosis of AML1-ETO+ leukemia cells by up-regulating miR-193a to repress the translation of AML1-ETO and inhibiting the expression of MDM2 and Cyclin D1.

[Key words] Decitabine； AML1-ETO； Leukemia； miR-193a特异性AML1-ETO（eight-twenty one）融合基因是由t（8；21）（q22；q22）染色体易位所导致，一般急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）发生的比例约12%～20%，但在M2 型中，该比例显著升高，为40%～80%[1]。世界卫生组织将AML伴有t（8；21）（q22；q22）定义为独立类型[2]。在各类型AML中，AML1-ETO+预后较好，患者经过大剂量阿糖胞苷化疗方案治疗后，疗效显著[3]。但近年来有研究发现，并不是所有患者均能取得较好的治疗效果，部分AML1-ETO+患者存在难缓解、易复发现象，而对于此类患者的治疗，国内外相关研究依然较少。有研究表明，AML1-ETO+细胞对去甲基化药物很敏感，尤其是DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制剂，如地西他滨（decitabine，DAC）和阿扎胞苷[4-8]。本实验旨在研究地西他滨抑制AML1-ETO+白血病细胞增殖和诱导凋亡，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人AML1-ETO+白血病细胞株Kasumi-1购自ATCC，MicroRNA-193a、U6、AML1-ETO和GAPDH引物合成自上海生工，序列见表1，AML1-ETO抗体购自Cell Signaling Technology，Caspase-3抗体购自Abcam，β-actin抗体购自Merch-Millipore，MDM2、Cyclin D1抗体购自Epitomics，CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所，Annexin V-FITC/PI购自Becton Dickinson（BD）公司。

1.2 细胞培养

Kasumi-1细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.3 CCK8法检测地西他滨抑制Kasumi-1细胞增殖

将Kasumi-1细胞分为6组，分别加入浓度为0、0.2、0.5、1、3和10 μmol/L的地西他滨，于24、48 h后加入CCK8，测其吸光度。

1.4 流式细胞术检测Kasumi-1凋亡

将1 μmol/L的地西他滨加入Kasumi-1细胞，分别于24 h、48 h收集细胞，PBS洗3次，重悬于1X的Binding Buffer，调整浓度至1×106/mL，取100 μL加入5 μL FITC AnnexinⅤ和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光放置15 min，加入400 μL 1X Binding Buffer，采用流式细胞仪FACS Calibur（Becton Dickinson公司）检测。

1.5 Western Blot检测相关蛋白的表达

将悬浮生长的Kasumi-1细胞直接离心，提取蛋白，每孔上样50 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳后转膜1 h，5%牛奶封闭2 h，Ⅰ抗孵育4℃过夜，0.1%TBST洗3次，每次10 min，Ⅱ抗孵育1 h，再0.1%TBST洗3次，每次10 min，加入ECL，在Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统上拍照，GEL PRO 4.0分析软件分析灰度值。

1.6 RT-PCR检测AML1-ETO和MiR-193a的表达

TRIZOL提取总RNA，用逆转录试剂盒（First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas）合成cDNA，用miR-193a和AML1-ETO上下游引物PCR扩增，分别以U6和GAPDH为内参，SYBR Green荧光染料法相对定量，使用ABI7500荧光定量PCR仪检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0数据分析软件，计量资料两两比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地西他滨抑制Kasumi-1细胞的增殖

加入地西他滨后，Kasumi-1细胞的增殖明显受到抑制，并且具有浓度效应和时间效应（表2）。

2.2 地西他滨诱导Kasumi-1细胞凋亡

加入地西他滨，24 h后Kasumi-1细胞的凋亡率为（9.83±1.71）%，与对照组（5.29±0.88）%比较有显著性差异（t=-4.08，P<0.05）；48 h后Kasumi-1细胞的凋亡率为（19.47±1.84）%，与对照组比较有显著性差异（t=-12.05，P<0.01），见封三图1。

2.3 地西他滨对AML1-ETO蛋白的影响

加入0.1、0.5和1 μmol/L地西他滨后，48 h后细胞内AML1-ETO蛋白随着浓度增加而减少，与对照组的比值分别为（0.85±0.21）、（0.28±0.06）和（0.10±0.07），有非常显著性差异（F=42.04，P<0.01），見图1A。加入1 μmol/L地西他滨后，24、48 h后AML1-ETO蛋白与对照组的比值为（0.31±0.21）和（0.24±0.11），也有非常显著性差异（F=27.60，P<0.01），见图1B。但RT-PCR显示地西他滨（1 μmol/L）并没有影响AML1-ETO mRNA的表达，24 h和48 h组与对照组的比值分别为（0.96±0.19）和（0.84±0.11），统计分析无显著性差异（F=1.22，P>0.05），见图1C。

2.4 地西他滨对Caspase-3蛋白的影响

本文用Western Blot法检测不同浓度地西他滨对Kasumi-1细胞中Caspase-3蛋白表达的影响，发现加入地西他滨后0.1、0.5和1 μmol/L组与对照组的比值分别为（1.14±0.27）、（0.85±0.19）和（1.01±0.38），统计分析无显著性差异（F=0.66，P>0.05），说明地西他滨没有改变Caspase-3的表达量（图2A）；加入Caspase阻滞剂Z-VAD-FMK，单独地西他滨和地西他滨联合Z-VAD-FMK组与对照组细胞AML1-ETO蛋白的比值分别为（0.23±0.04）和（0.22±0.05），两组之间无统计学差异（t=0.33，P>0.05），说明地西他滨并不是通过Caspase-3来影响AML1-ETO蛋白（图2B）。

2.5 地西他滨对miR-193a的调控

加入地西他滨后，miR-193a出现上调（图3A），24 h和48 h分别上升了（3.61±0.06）和（6.99±0.74）倍，各组间有非常显著性差异（F=149.33，P<0.01）。通过预测软件Target Scan（http：//www.targetscan.org）发现miR-193a与ETO基因有部分互补（图3B），其可能通过阻滞AML1-ETO基因的翻译而不影响mRNA的稳定性从而减少AML1-ETO蛋白。本研究又检测了miR-193a下游的MDM2和Cyclin D1两个蛋白，发现均出现下调（图3C），MDM2蛋白加药组与对照组的比值为（0.51±0.19）（P<0.05），Cyclin D1蛋白加药组与对照组的比值为（0.50±0.10）（P<0.01），说明地西他滨可能正是通过miR-193a来调控这两个蛋白，从而影响细胞增殖和凋亡。

3 讨论

急性髓系白血病是恶性血液病中较常见的一种疾病，规范化疗可达到60%～80%的缓解率，但长期生存率仅为10%～15%。近年来，随着分子生物学的发展，发现了很多白血病伴有特定的染色体异常，其中一些与预后有密切关系。t（8；21）是AML中较常见的染色体异常之一，主要出现于FAB分型（French-American-British classification systems）中的M2型AML（发生率为18%～40%）[9，10]，也可见于M1、M4、M5型。t（8；21）AML 是一类异质性很大的疾病，虽然部分患者经过造血干细胞移植后能获得长期生存，但仍有40%患者化疗或移植后复发，其难治复发的原因和机制尚不清楚，因此此类AML的治疗成为血液病领域的难点和热点。t（8；21）易位产生AML1-ETO蛋白，它能抑制普通AML1蛋白的功能，导致造血细胞生物学特性改变，从而在白血病的转化过程中起到关键作用[11，12]。

地西他滨（DAC）是一种可阻止DNA甲基化过程的特异的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，其在高浓度时可抑制DNA合成，发挥其细胞毒作用，进而诱导细胞死亡，而低浓度时可使DNMT失活，发挥其去甲基化作用，使抑癌基因重新表达[13]。该药分别于2006年4月和5月在欧洲及美国上市，主要适应证为原发性和继发性的骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）。随后的进一步研究表明，其对急性髓细胞白血病（AML）、慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia，CMML）等也有疗效[14-16]，目前国内有地西他滨用于治疗AML1-ETO+白血病的报道[17，18]，但对其机制了解较少。

本文在实验中发现地西他滨能够抑制AML1-ETO+白血病细胞株Kasumi-1的增殖，并且其抑制率随着浓度和时间的增加而增加；用流式细胞术检测1 μmol/L地西他滨作用下，Kasumi-1细胞凋亡率明显增加，证明地西他滨能够有效地抑制AML1-ETO+细胞的增殖并诱导凋亡。随后我们又对其作用机制进行研究，发现AML1-ETO蛋白随着地西他滨的浓度和作用时间的增加而减少，而其mRNA表达水平并没有明显改变。因此我们猜测，地西他滨对AML1-ETO的调控应该是在转录水平之后。

Caspase-3是一种蛋白剪切酶，国外有文献报道Caspase-3能够剪切AML1-ETO蛋白[19-20]。因此我们怀疑地西他滨是否通过Caspase-3来直接剪切AML1-ETO蛋白从而使之降解，而不影响mRNA的表达。本文检测了不同浓度地西他滨作用下的Caspase-3，发现并没有发生改变；而用Caspase阻滞剂Z-VAD-FMK阻滞Caspase-3的剪切功能，发现加入地西他滨后，AML1-ETO蛋白依然降低，Z-VAD-FMK没有起到阻滞作用，因此判断地西他滨对AML1-ETO的调控并不是通过Caspase-3途径。

本文还发现地西他滨能够上调Kasumi-1细胞中的microRNA 193a，而miR-193a与ETO基因有部分互补，而当microRNA与靶基因不完全互补时，其调控机制是阻遏翻译而不影响mRNA稳定性，与本实验结果相符合。本研究又检测了miR-193a调控的Cyclin D1和MDM2蛋白，发现地西他滨能够下调这两个蛋白。MDM2是一种泛素蛋白连接酶，其高表达能抑制抑癌基因P53的激活，而P53基因正是細胞凋亡的重要调控基因。Cyclin D1是细胞周期的正调节因子，其过表达可以加速细胞G1期向S期转化，促使细胞增殖，使细胞处于不断增殖的类似前体细胞的状态。这两个蛋白正与细胞增殖和凋亡相关（封三图2）。

综上所述，本研究得出结论，地西他滨可能通过对CpG岛（CpG island）的去甲基化从而上调miR-193a，miR-193a能够阻遏AML1-ETO的翻译，并且miR-193a还下调Cyclin D1和MDM2，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡。

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（收稿日期：2018-01-15）