NSCLC患者血清miR系列基因表达水平及与化疗疗效的相关性研究

陈群 石琴

[摘要] 目的 探討非小细胞肺癌（non-small lung cancer， NSCLC）患者血清miR （microRNA）系列基因表达水平及与化疗疗效的相关性。 方法 2011年3月～2016年9月选择200例未经任何抗癌治疗的NSCLC患者作为NSCLC组，100例健康志愿者作为健康组，分别收集血清样本；25例晚期NSCLC患者化疗前和化疗后的血清样本。采用qRT-PCR方法检测NSCLC组和健康组中血清miR系列基因表达水平，判断血清miR系列基因表达水平与预后的关系。 结果 NSCLC组的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表达与健康组存在差异（P<0.01）。NSCLC患者的血清上述基因表达化疗前与化疗后存在明显差异（P<0.05）；健康组的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表达与化疗前患者存在明显差异（P<0.05），与化疗后的患者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 NSCLC患者血清存在高水平miR系列基因表达，化疗可降低miR系列基因表达水平，上述6种miR基因血清表达有助于NSCLC的诊断、预测和预后的判断，联合检测有助于敏感性的提高。

[关键词] 非小细胞肺癌；miR系列基因；预测；预后

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）15-0018-04

Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and chemotherapy efficacy in NSCLC patients

CHEN Qun SHI Qin

Department of Oncology， Fuzhou Pulmonary Hospital of Fujian， Clinical Teaching Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350008， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression levels of serum miR（microRNA） gene and chemotherapy efficacy in the patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）. Methods From March 2011 to September 2016， 200 NSCLC patients without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. 100 healthy volunteers were selected as the healthy group. Serum samples were collected separately； serum samples before and after chemotherapy in 25 patients with advanced NSCLC were collected. The qRT-PCR method was used to detect the expression level of serum miR gene in NSCLC group and healthy group， and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was determined. Results The serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a， and miR-92-1 in the NSCLC group were different from those in the healthy group（P<0.01）. There were significant differences in the expressions of the above genes before and after chemotherapy in the serum of NSCLC patients（P<0.05）； the serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a and miR-92-1 in the healthy group were significantly different from those before chemotherapy（P<0.05）. There was no statistical difference compared with the patients after chemotherapy（P>0.05）. Conclusion There is a high level of miR gene expression in the serum of NSCLC patients. Chemotherapy reduces miR gene expression levels. The above six miR gene serum expressions contribute to the diagnosis， prediction and prognosis of NSCLC. The joint detection helps increase sensitivity.

[Key words] Non-small cell lung cancer （NSCLC）； miR gene； Prediction； Prognosis

中国恶性肿瘤中发病率和病死率最高的是肺癌，而且非小细胞肺癌（NSCLC）占85%，常见临床分期是ⅢB或Ⅳ期。化疗依然是晚期NSCLC不可替代的手段，其治疗目标是延长患者总生存期（OS）、提高生活质量（QOL）、降低疾病相关的并发症。虽然，针对肺癌的化学预防和治疗已经取得了一些进展，但肺癌治疗效果依旧不佳，近年来的研究表明肺癌的发生与转移是一个极其复杂的多基因调控的多阶段、多步骤过程。因此，从基因表达调控方面研究肺癌发生发展的机制，了解肺癌治疗预测的相关因素，能更精准预测化疗疗效，优化治疗方案，提高肺癌患者的生活质量和远期生存率已经十分必要。microRNA（miRNA）是一类具有在转录后水平调控基因表达功能的非编码小分子miRNA，在细胞的生长、增殖、代谢、凋亡等方面都有着重要的作用。通过监测NSCLC患者血清miR系列基因化疗前后的变化，从而确定化疗效果。本研究涉及6个指标miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1的血清检测，主要是观察比较NSCLC患者化疗前后血清miRNA的表达水平的改变，分析该改变对化疗疗效的影响，为血清miRNA在NSCLC治疗中的相关研究提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例收集 分别收集2011年3月～2016年9月间的225例经病理组织学或细胞检查证实的NSCLC患者，其中，200例采集抗癌治疗前的血清样本，作为NSCLC组，男133例，女67例，中位年龄65岁；另外，25例为晚期NSCLC患者，给予至少2个周期以上的常规一线化疗，分别采集化疗前和化疗2个疗程后的血清样本，作为治疗组，男16例，女9例，中位年龄63岁。选取100例正常体检且各项指标正常的健康体检者的血清样本，作为健康组，男63例，女37例，中位年龄59岁。三组对象在性别、年龄方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。按期整理临床治疗资料。

1.1.2 入选标准[1，2] 患者年龄18～75岁，男女不限；化疗患者具有化疗的指征，ECOG评分0～1分；生存时间≥3个月；具有可测量的病灶，胸片、普通CT或MRI扫描病灶≥20 mm，螺旋CT或PET-CT扫描病灶≥10 mm；机体上没有未愈合的创伤；体检符合要求，外周血象：WBC≥4.0×109/L，PLT≥80×109/L，Hb≥90 g/L。肾功能：Cr≤2.0×UNL（正常上限）。肝功能：BIL≤2.0×UNL，ALT/AST≤5.0×UNL。心电图基本正常；依从性好，配合血清样本采集。

1.1.3 排除标准[1，2] 不符合入选标准者；具有严重的心肺功能衰竭；腹泻（水样便）或麻痹性肠梗阻；无法进行疗效评价者；未得到控制的糖尿病；急性感染；孕妇和哺乳期妇女；健康组曾患有恶性肿瘤，NSCLC患者合并第二原发恶性肿瘤。

1.1.4 剔除标准[1，2] 未按上述标准入组并完成有关检查治疗者；因故和无故明显推迟给药时间超过2周者。观察期间合并使用其他抗肿瘤化疗药物者；化疗患者观察期间对靶病灶同时进行放疗者，或兼做其他抗肿瘤方案者。

1.2 方法

1.2.1 RNA分离提取 按照试剂说明书，血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC處理水中，-80℃保存。RNA浓度使用Nanodrop 2100（Nanodrop，Wilmington，DE）测量。

1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析 差异表达使用两步方法的实时定量逆转录聚合酶链反应分析。第一步cDNA的反转录，第二步是实时定量逆转录聚合酶链反应。miRNA的反转录相关操作按照试剂盒One Step PrimeScript®；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，反转录的反应体系为[3，4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1%BSA 2 μL，microRNA Prims Script®；RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 5 μL。反转录反应条件：37℃ 60 min，85℃变性5 s。microRNA的实时定量逆转录聚合酶链反应遵照试剂盒SYBR®；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，实时定量逆转录聚合酶链反应体系为SYBR®；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，Uni-miR qPCR Primer 1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。实时定量逆转录聚合酶链反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸30 s，共进行40个循环。定量PCR使用ABI7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）执行，每个样本平行重复3次，采用U6 snRNA 做参考基因，2-△△Ct method 用于计算基因表达倍数变化。

1.3 统计学方法

数据分析使用SPSS21.0软件（SPSS，Inc.，美国），所有数据均符合正态分布，计量资料以（x±s）表示，组间数据使用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组与健康组血清miRNA基因表达比较

由表1可知未经抗癌治疗的NSCLC患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表达较健康组明显上调，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 化疗前、后的血清miR系列基因表达比较

25例晚期NSCLC患者化疗前和化疗2个疗程后的血清miR系列基因表达水平，见表2。NSCLC组化疗2个疗程后的患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表达与化疗前存在明显差异（P<0.05）；健康组的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表达与化疗前患者存在明显差异（P<0.05），与化疗后的患者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

肺癌是当今发病率和病死率最高的恶性肿瘤，化疗是晚期NSCLC不可替代的常用治疗手段，但缺乏可靠的疗效预测和生存预后方法。miRNA是一类小的、不具有蛋白质编码功能的RNA。miRNA在肿瘤生长、增殖、扩散、转移、侵袭等方面起主要作用，Yan等研究[5]显示，约50%的miRNAs基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点，而且不同类型的肿瘤中具有明显不同的miRNAs表达谱[6]，某些关键miRNA表达水平的失衡可能是肿瘤发生和发展的重要因素。血清miRNA可作为多种人类疾病的标志物[7]，研究显示[8-11]，循环血miRNA在食道癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的早期诊断、肿瘤分期和预后效果等方面具有重要的警示作用。

在NSCLC的研究中[12-15]，显示miR系列中的部分基因包括NSCLC在内的多种肿瘤患者的血清中存在稳定的高表达，极少受外界环境及自身的生理状态的影响，而且化疗后明显降低，可成为很好的评价化疗的效果[16，17]。Yu等[18]对112例NSCLC患者进行检测，通过Cox模型和风险评分发现了5个预测NSCLC治疗效果的miRNA信号，检测循环血中的miRNA不失为一种非侵袭性诊断和治疗肺癌有价值的方法，还可以预测和检测某些药物的治疗效果[19]。但是大部分学者只研究1个miRNA基因或2个，评价肿瘤治疗的效果十分有限。另外，肿瘤的生物学指标的表达可能与临床病理特征和预后间存在一定的关联。因此，准确判定晚期肺癌的预后因素仍存在挑战。除去单因素风险因子的考虑外，联合的miRNA基因表达水平分析能否进一步提高肺癌预后的准确性？

本项目拟在前期研究基础上，进一步深入研究miRNA基因簇成员（miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）在NSCLC血清中的表达情况，分析血清表达水平与化疗疗效和生存期的相关性。在此基础上，对于有意义的miRNA联合为一个参考指标，比较NSCLC患者化疗前后血清miRNA的表达水平的改变，探讨其对肺癌预测和预后的影响。本研究将有助于进一步了解miRNA基因簇成员在NSCLC的作用，并作为其疗效和生存等分子标志物的依据。结果显示，miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1在NSCLC患者血清中的表达水平明显较健康人群上调，说明更多的血清miRNA有助于NSCLC的诊断，而且部分早期的NSCLC患者就有多项指标表达水平显著高于健康人群，有必要进一步研究其在NSCLC早期诊断的价值。此外，化疗明显降低上述基因在晚期NSCLC患者血清中的表达水平，说明上述6种血清miR基因有助于晚期NSCLC患者化疗的疗效预测。另外，患者分期愈晚，上述6种血清miR基因呈现高表达的项次愈多；而高表达项次愈多，其生存期也愈短，说明6种血清miR基因有助于预后的判断，联合检测也有助于提高敏感性和特异性。当然，血清miR基因能否作为NSCLC患者临床诊断、预后、预测的指标，不仅仅是血清有否高表达，还需明确阈值以及联合检测的意义，尚需更多的研究来验证。

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（收稿日期：2018-01-09）