重庆合川区猪源沙门氏菌的分离鉴定及药敏分析

艾鑫，董欣炜

（1.天津威特生物医药有限责任公司，天津 300301；2.康地饲料添加剂（北京）有限公司，北京 100020）

沙门氏菌是一种重要的人兽共患病病原，广泛存在于自然界、人和动物肠道，能够引起人类和多种动物发病，如人的伤寒、副伤寒，猪副伤寒，禽类的鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒，反刍动物腹泻等。更为重要的是，该菌常常污染动物性食品，随食物链进入人体。近年来，随着抗菌药物大量使用，多重耐药沙门氏菌菌株广泛出现，这更增加了动物源沙门氏菌感染人类发病之后的治疗难度，增加治疗成本。

为了解重庆市合川区猪源耐药沙门氏菌的流行情况，为养殖企业的临床用药提供指导，本试验对合川区部分猪场的沙门氏菌进行了分离鉴定，并测定其对26种抗菌药物的敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 沙门氏菌菌株 CQFL7PS001菌株由本公司实验室保存。

1.1.2 试剂及药品 MH培养基、沙门氏志贺氏菌属增菌培养基、药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；XLD培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司。26种药敏纸片包括：（1）β-内酰胺类：（A）青霉素类：氨苄西林，（B）头孢菌素类：头孢氨苄、头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟，（C）碳青霉烯类：亚胺培南，（D）单环内酰胺类：氨曲南；（2）氨基糖苷类：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星；（3）四环素类：四环素、多四环素；（4）酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考；（5）喹诺酮类：萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、依诺沙星；（6）磺胺类：复方新诺明、甲氧嘧啶。

1.1.3 样品采集 2017年11月至2018年3月于重庆市合川区的3家规模化养猪场采集猪粪样品：用无菌棉签取1 g左右的粪便于2mL灭菌离心管中。采集的所有样本均置于有冰袋的泡沫箱中，6h之内运回实验室进行处理。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 在每个装有猪粪便的离心管中加入1mL PBS，振荡后静置2h，使细菌从粪便中游离出来。重悬后吸取200μL PBS于灭菌的沙门氏志贺氏菌属增菌液中，220r/min 37℃培养6～12h，样品增菌后，将菌液划线于XLD琼脂平板，37℃培养24～28h。

1.2.2 沙门氏菌疑似菌株的形态学观察 从XLD平板划线区挑取3个圆形、光滑的单菌落接种于LB琼脂平板，37℃培养48h，再从LB平板上挑取单菌落，革兰氏染色后观察细菌形态。根据形态观察结果，将疑似细菌菌落再次接种于LB液体培养基，37℃220r/min振荡培养8h。

1.2.3 沙门氏菌分子生物学检测

（1）沙门氏菌特异性基因的引物设计与合成：根据GenBank中公布的invA基因全序列，用引物设计软件Primer Premier 5.0设计特异性引物，交由英潍捷基公司合成。引物序列invA-F：5′-GTGAAATTAT CGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-R：5′-TCATCGCAC CGTCAAAGGAACC-3′。

（2）PCR模板的制备：将疑似菌落接种于LB液体培养基，37℃ 220 r/min振荡培养8 h；取1.5 mL菌液于室温下13000r/min离心2min，弃上清；加入1 mL灭菌ddH2O重悬，室温下13000r/min离心2min，弃上清；加入 70 μL ddH2O，105℃处理 10 min，然后置于冰上冷却，以13 000r/min离心1min，取上清作为PCR反应的模板，-20℃保存备用。

（3）沙门氏菌的PCR鉴定：PCR扩增反应体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，invA-F（10 pmol/μL）0.5μL，invA-R（10pmol/μL）0.5μL，模板 DNA 0.5μL，ddH2O 11μL，总反应体系25μL。PCR反应条件：94℃预变性 5 min；94℃变性 15 s，58℃退火 15 s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸6min。

1.2.4 药物敏感性试验 采用KB纸片扩散法将保存的菌种划线接种于LB平板，37℃培养20h左右；挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃ 220 r/min振荡培养至菌液OD600值为0.11（0.5个麦氏比浊单位）；用移液枪吸取100μL菌液至Mueller-Hinton平板，用无菌棉签均匀涂抹，室温放置3～5min；待培养基表面水分吸干后，用眼科镊将药敏纸片贴于平板表面（纸片一旦与平板接触不应再移动），每个纸片中心相距大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm，于37℃恒温箱培养15h后，测量各药敏纸片的抑菌圈直径。药物敏感性结果根据《动物源抗菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准》和《抗菌药物敏感性试验执行标准第二十五版资料增刊》判定。

2 结果

2.1 菌株分离情况 通过形态学观察和PCR鉴定，在50份粪便样品中分离到10株沙门氏菌，分离率为20.0%。分离的10株菌均能特异性地扩增出284bp的invA基因片段（图1）。

图1 沙门氏菌PCR鉴定结果

2.2 药敏试验结果 本次在合川区分离的菌株对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、链霉素、氧氟沙星完全敏感；对头孢西丁、氨曲南的敏感性也较高，仅1株有耐药性；对四环素、氟苯尼考完全耐药；对庆大霉素、多西环素、氯霉素、环丙沙星、甲氧嘧啶的耐药率为90%；对卡那霉素、复方新诺明的耐药率为80%；对萘啶酸的耐药率为70%；对头孢氨苄的耐药率为50%；对氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻肟、亚胺培南、阿米卡星、诺氟沙星、恩诺沙星、依诺沙星的耐药率在20%～40%（详见表1）。所有菌株均为多重耐药菌株，除1株分离菌外，其余菌株均对10种及以上药物耐药，特别是菌株1、2、3、5，耐药数量超过50%。

表1 10株沙门氏菌对不同抗菌药物的敏感性

3 讨论

沙门氏菌是一类在世界范围内广泛存在的食源性细菌[1]，我国22.2%的食源性疾病由沙门氏菌引起，是第四大食源性疾病[2]。沙门氏菌血清型众多，目前已经发现超过2600种血清型[3]。根据宿主感染范围，沙门氏菌分为宿主适应性血清型和非宿主适应性血清型。非宿主适应性血清型指能感染多种动物和人的血清型，如鼠伤寒沙门氏菌、德尔俾沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等。

近30年来，抗菌药物在动物养殖上的广泛应用使得耐药菌株迅速增加，有研究者报道，食品动物中抗菌药物的滥用和病原菌耐药之间存在密切联系[4]。沙门氏菌多重耐药菌株的出现，已经严重影响到公共卫生安全。因此，对动物和动物源性食品中沙门氏菌耐药性的监测，对于保证食品安全和贸易都十分重要[5-6]。

药物敏感性试验表明，所有分离菌株均为多重耐药株，说明合川区养猪场使用抗菌药物极其普遍和不规范。还存在对人用抗菌药物的耐药现象，如对碳青霉烯类抗生素——亚胺培南和单环内酰胺类抗生素——氨曲南均有耐药性。从表1可见，10株临床分离菌对亚胺培南和氨曲南分别有20%和10%的耐药率。亚胺培南和氨曲南是人专用抗生素，在动物源性沙门氏菌中出现耐药菌株，可能与其他耐药质粒同时携带耐碳青霉烯类和单环内酰胺类药物基因有关[7]。