红芪多糖3的荧光标记及其组织分布研究

师志强，张雪梅，薛志远，陈 宇，杨亚飞，封士兰*，赵良功

(1.兰州大学药学院，兰州 730000；2.昆明学院医学院，昆明 650214；3.兰州大学第二医院，兰州 730000)

植物多糖具有广泛的生物活性，受到研究学者的高度关注[1-3]。由于多糖结构中缺少发光基团，难以直接检测。现多采用荧光物质对多糖进行标记，进而开展多糖的分子作用机制和代谢动力学研究[4]。FITC具有量子产率高、寿命长、光稳定性好和温度系数低等优点，是目前应用最广泛的荧光素之一[5]。目前已实现对麦冬多糖、树舌多糖、枸杞多糖、小刺猴头菌多糖和红毛五加多糖等的FITC标记[4，6-9]。

红芪多糖(Hedysarumpolybotys saccharide，HPS)具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力、抗骨质疏松和抗肝纤维化等生物活性[10-14]，课题组前期研究发现，HPS-3由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成[15]。本文利用红芪多糖具有还原性末端的特点，通过半缩醛基的还原胺化反应引入仲氨基，进而与FITC发生亲核反应，实现多糖的荧光标记。并对HPS-3-FITC在小鼠体内的组织分布进行研究，为其代谢组学和药效作用机制研究奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1仪器 FA2014型电子分析天平(上海市安亭电子仪器厂)；紫外可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；RF-5301pc型荧光分光光度计(日本岛津公司)；CR22G Ⅱ型离心机(日本日立公司)；冷冻干燥器(美国labconco公司)；N1100型旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；T10 basic ULTRA-TURRAX型分散机(德国IKA公司)。

1.2材料 红芪多糖3由本课题组自制[15]；异硫氰酸荧光素、氰基硼氢化钠和4-羟基苯乙胺(Tyr)均购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、苯酚和硫酸等试剂均为市售分析纯。

1.3动物 昆明种小鼠90只，雄性，体质量20±2 g，由兰州大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(甘)2015-0012)。

2 方法

2.1HPS-3的荧光标记 取400 mg HPS-3溶于15 mL 0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH值为8.0)，依次加入400 mg Tyr和150 mg 氰基硼氢化钠，于37 ℃水浴反应96 h，间或振荡。反应完毕，离心，取上清液，过Sephadex G-100 柱，蒸馏水洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法测定各管糖含量及280 nm处的吸光度值，绘制HPS-3-Tyr的洗脱曲线，按照洗脱曲线收集洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-Tyr。

将HPS-3-Tyr溶于蒸馏水，用0.5 mol·L-1的Na2CO3调节pH值至8.5，加50 mg FITC，室温下避光反应过夜，向反应物中加入4倍量无水乙醇，有黄绿色沉淀析出，离心，弃上清液，沉淀加水复溶，乙醇再次沉淀，反复3次，条件同上。用水溶解沉淀，溶液上Sephadex G-100柱纯化，蒸馏水洗脱，测定各管糖含量和荧光吸收值(λex=492 nm，λem=518 nm)，收集相应洗脱液，冷冻干燥，得HPS-3-FITC，避光保存[16]。

2.2UV-Vis光谱和荧光分光光谱扫描分析 取HPS-3、HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC适量，分别配制成质量浓度为1 mg·L-1的溶液，在200～800 nm范围内进行紫外可见光谱扫描。在激发波长400～550 nm和发射波长 450～600 nm 范围内进行荧光光谱扫描。

2.3荧光取代度测定 精密移取质量浓度为0.122 8 μg·mL-1的FITC溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL，分别加入7支锡箔纸包裹的刻度试管，加入PBS缓冲液定容至10.0 mL。以PBS缓冲液为空白对照，依次测定各管的荧光强度。以FITC的质量浓度为横坐标(x)、荧光强度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算回归方程。将HPS-3-FITC配制成质量浓度为0.359 2 μg·mL-1的PBS缓冲液，测定其荧光强度，代入回归方程，计算HPS-3-FITC的荧光取代度。

2.4小鼠各组织中HPS-3-FITC和FITC定量分析方法的建立 以心脏中HPS-3-FITC的定量分析方法建立为例。

2.4.1对照品溶液的制备 精确称取HPS-3-FITC样品适量，配制成质量浓度为0.576 8 mg·mL-1的对照品溶液。取小鼠空白组心脏匀浆液200 mL，加入适量上述制备的的对照品溶液，分别制备高(28.84 μg·mL-1)、中(2.884 μg·mL-1)和低(0.360 μg·mL-1)3个质量浓度的组织样品，作为质控样品。

2.4.2标准工作曲线的绘制 精密移取小鼠空白组心脏匀浆液200 μL,加入2.4.1项下制备的对照品溶液适量，配制成质量浓度分别为0.360，0.721，1.442，2.884，5.768，14.42和28.84 μg·mL-1的系列溶液，加PBS缓冲液补足至2.5 mL，测定荧光强度，同时以PBS缓冲液替代HPS-3-FITC对照品溶液作为空白对照。以组织匀浆液中待测样品HPS-3-FITC的质量浓度为横坐标(x)，测定的荧光强度扣除空白组织匀浆液的荧光强度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，并计算回归方程[17]。

2.4.3方法回收率与精密度 取2.4.1项下制备的高、中和低3个质量浓度的质控样品，测定荧光强度，代入标准曲线求得实测质量浓度，计算方法回收率。1 d内连续测定，得到日内差；连续3 d进行测定，得到日间差。

2.4.4方法稳定性 取2.4.1项下制备的高、中和低3个质量浓度的质控样品，在室温下放置24 h后，测定荧光强度，代入标准曲线分别求得样品的质量浓度，计算RSD值。

2.5生物样品采集及处理 取90只昆明小鼠，随机分成15组，每组6只，其中7组尾静脉注射160 mg·kg-1HPS-3-FITC，7组尾静脉注射2.74 mg·kg-1FITC，剩余1组尾静脉注射生理盐水作为空白组，给药后0.25，0.5，1，2，4，8和24 h摘眼球采血后处死，立即解剖，采集心、肝、脾、肺、肾、胃、肠和脑，用PBS缓冲液洗净，滤纸吸干，精密称定质量，加入9倍体积的PBS缓冲液，制备组织匀浆液。取组织匀浆液200 μL，加入PBS缓冲液补足2.5 mL，混匀，使用荧光分光光度计在λex=492 nm，λem=518 nm条件下测定荧光强度。

3 结果与讨论

3.1HPS-3-FITC的合成 多糖胺化还原后产物经Sephadex G-100 柱的洗脱曲线见图1A。多糖峰与Tyr第一吸收峰重合，紫外可见扫描光谱显示：HPS-3-Tyr在280 nm附近有1个明显的吸收峰，说明多糖与酪胺成功结合，见图2。

HPS-3-Tyr经FITC亲核加成后洗脱曲线见图1B。多糖峰与FITC荧光吸收峰重合，在图2中HPS-3-FITC在490 nm附近有1个明显吸收峰，表明FITC已被偶联到HPS-3-Tyr上。

3.2荧光分光光谱分析 HPS-3-FITC冻干后为橙黄色粉末，其水溶液呈黄绿色。经过荧光分光光谱扫描发现，未标记的HPS-3没有激发波长λex和发射波长λem；FITC：激发波长λex=493 nm，发射波长λem=521 nm；HPS-3-FITC：激发波长λex=492 nm，发射波长λem=518 nm。可知FITC结合多糖后激发波长和发射波长未见明显变化。

图1HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC的洗脱曲线

A.HPS-3-Tyr；B.HPS-3-FITC。

Fig.1 Elution curve of HPS-3-Tyr and HPS-3-FITC

A.HPS-3-Tyr；B.HPS-3-FITC.

图2HPS-3，HPS-3-Tyr和HPS-3-FITC紫外可见扫描图谱

Fig.2 UV-Vis spectra of HPS-3,HPS-3-Tyr and HPS-3-FITC

3.3荧光取代度 FITC的标准曲线回归方程为：y=20.648x+38.168(2.456～17.92×10-3) μg·mL-1，r=0.999 2)，经检测HPS-3-FITC的荧光强度为164.826，计算HPS-3-FITC的荧光取代度为1.71%。

3.4各组织中HPS-3-FITC定量分析方法研究结果

3.4.1线性关系 以组织匀浆液中待测样品HPS-3-FITC的质量浓度为横坐标(x)、测定的荧光强度扣除空白组织匀浆液的荧光强度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，各组织的线性回归方程和相关系数结果见表1，均满足生物样品测定要求。

3.4.2回收率与精密度 各样品的回收率与精密度结果见表2。均满足生物样品的测定要求。

3.4.3方法稳定性 各样品在室温下放置24 h后，HPS-3-FITC的含量均大于加入量的88%，RSD值均小于10%；满足生物样品的测定要求。

表1HPS-3-FITC在血浆及各组织的线性回归方程

Tab.1 Equations of linear regression of HPS-3-FITC in plasma and tissues

样品标准曲线线性范围/μg·mL-1r心y=6.090 5x-1.296 10.360～28.840.998 6 肝y=4.068 4x+1.087 40.360～57.680.999 7脾y=5.890 9x-0.289 10.360～28.840.999 8 肺y=5.971 9x-1.375 30.360～115.360.999 8 肾y=8.225 8x-1.292 30.360～86.520.999 5 胃y=5.136 8x-0.149 60.360～28.840.999 6 肠y=6.573 4x-1.704 70.360～28.840.999 2 脑y=10.637x+0.732 90.360～28.840.999 5

3.5各组织中FITC定量分析方法研究结果 参照2.4项下方法，FITC在各样品中的线性回归方程的相关系数均大于0.99；各样品的高、中和低质量浓度的回收率为89.29%～103.18%，RSD值均小于13.1%，各样品的高、中和低质量浓度的日内和日间精密度RSD值均小于11.2%。各样品高、中和低3个质量浓度的稳定性良好，RSD值均小于12.7%，均满足生物样品的测定要求。

3.6组织分布及靶向性研究 尾静脉注射给药后，采集的组织样品按照2.5项下方法测定药物质量浓度。根据各样品中的药物质量浓度绘制药物质量浓度-时间曲线，采用梯形法计算各组织中药物的AUC值，并以各组织的AUC总和为参比，计算各组织的Te(靶向效率)，Te=AUC÷∑AUC×100%，结果见表3。通过比较各组织的Te值，可发现各组织对HPS-3-FITC和FITC靶向效率不完全一致，HPS-3-FITC主要集中在肾、肝和肺3个组织，三者的Te值之和为87.73%，FITC主要集中在肝和肾组织，二者的Te值之和为97.28%。两者的脏器分布情况不一致，间接说明了HPS-3-FITC给药后各组织中的荧光响应来源于标记后的多糖。

表2HPS-3-FITC的方法回收率与精密度

样品加入量/μg·mL-1测得量/μg·mL-1平均回收率/%RSD/%RSD/%日内差日间差心0.3600.374±0.032103.673.115.225.532.8842.844±0.04398.624.417.336.1128.84027.376±0.03494.933.533.502.81肝0.3600.340±0.03994.354.118.327.772.8842.923±0.057101.355.635.664.4857.68053.705±0.00893.110.842.073.34脾0.3600.342±0.06494.896.749.008.842.8842.705±0.02493.792.541.624.0428.84027.914±0.04796.794.891.255.35肺0.3600.360±0.03899.903.822.854.235.7685.522±0.05595.735.723.816.36115.360110.026±0.04495.384.611.544.78肾0.3600.353±0.07898.037.925.303.485.7685.339±0.02792.572.913.944.3786.52083.175±0.01396.131.365.144.10胃0.3600.366±0.085101.428.418.898.902.8842.873±0.05099.615.024.865.5928.84027.738±0.01196.181.123.183.92肠0.3600.347±0.02596.162.569.096.262.8842.798±0.06097.016.145.174.9728.84029.289±0.044101.554.343.854.69脑0.3600.322±0.05889.306.497.467.732.8842.835±0.02798.292.711.873.5328.84026.267±0.01791.081.871.782.54

表3HPS-3-FITC和FITC在血浆和各组织中的药动学参数

Tab.3 Pharmacokinetic parameters of HPS-3-FITC and FITC in plasma and tissues (n=6)

4 结论

本研究通过胺化还原的方法，在HPS-3的还原性末端的半缩醛基引入酪胺生成HPS-3-Tyr，再通过与FITC发生亲核反应生成HPS-3-FITC，从而实现对HPS-3多糖的荧光标记。产物经紫外可见扫描光谱和荧光光谱分析，证实标记成功，其荧光取代度为1.71%。

使用荧光分光光度法建立了小鼠组织中HPS-3-FITC和FITC的定量分析方法，该方法简单快速，其线性、稳定性、回收率和精密度均符合生物样品的测定要求，避免了液相色谱法测定时复杂的样品前处理过程。根据HPS-3-FITC给药后各组织的AUC值，组织中含药量分布顺序从高到低依次为肾、肝、肺、心、脾、肠、胃、脑，其中绝大多数聚集在肾、肝和肺。肾脏分布最多，说明肾脏对HPS-3有很强的摄取能力，祁雪艳等[18]研究发现，红芪多糖有抗糖尿病肾病的作用，推测红芪多糖可能直接作用于肾脏而发挥药效，且药物主要通过肾脏排出；肝脏分布其次，说明肝脏对HPS-3有较强的摄取能力，药物主要通过肝脏代谢。前期的药效学实验研究结果表明，红芪多糖具有良好的抗肝损伤作用[19]。推测红芪多糖直接作用于肝脏靶器官而发挥药效；肺部也有较大吸收可能是肺部存在大量的血管，静脉注射后，大量药物进入肺部，提示HPS-3可用于治疗某些肺部疾病，与李菲等[20]研究结果一致。

实验结果表明，FITC对红芪多糖HPS-3进行荧光标记是成功的，建立的体内组织中定量分析方法和组织分布实验为进一步研究红芪多糖的药效作用机制和相关代谢组学奠定了基础。