一测多评法测定银屑配方颗粒中4种生物碱的含量

张 伟，马桂芝，王春芳，滕 亮

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院药学部，乌鲁木齐 830011)

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，与遗传、免疫功能紊乱、感染和环境等多种因素有关[1-2]。某医院用于治疗银屑病的银屑配方颗粒由山豆根、白鲜皮、土茯苓、拳参、苦参、丹参、火麻仁、玄参和地黄组成，在临床应用中有患者出现胃肠道不良反应。文献调研表明，方中苦参和山豆根中的化学成分以生物碱为主，这类喹诺里西啶类生物碱成分既是活性药效成分，也是引发毒性反应的成分[3]。苦参碱类生物碱可引发胃肠道不良反应，严重者可致肌肉痉挛或全身抽搐，甚至导致呼吸停止而死亡[4]，还可引起神经毒性和肝毒性等不良反应[5-8]。为了探讨银屑配方颗粒的物质基础并对其生物碱含量进行质量控制，有必要对该方中苦参类生物碱进行含量测定。因此，本文建立了一种同时测定银屑配方颗粒中4种生物碱含量的HPLC法。

1 仪器与试药

1.1仪器 New Classic MF分析天平(瑞士梅特勒-托利多精密仪器有限公司)；KQ500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LC-20AD 高效液相色谱仪，SPD-M20A 230 V 光电二极管阵列紫外可见光检测器，Wondersil C18色谱柱(日本岛津公司)；Milli-Q 艾柯超纯水仪 (美国密理博公司)。

1.2试药 山豆根配方颗粒(批号20170113)、白鲜皮配方颗粒(批号20161216)、土茯苓配方颗粒(批号20161117)、拳参配方颗粒(批号20151228)、苦参配方颗粒(批号20160909)、丹参配方颗粒(批号20161208)、火麻仁配方颗粒(批号20161218)、玄参配方颗粒(批号20161209)和地黄配方颗粒(批号20161103)，均购自广东一方制药有限公司；苦参碱对照品(批号X05J6M6)、氧化苦参碱对照品(批号Y30S6Y17043)和槐果碱对照品(批号Y06M8Y17029)，均购自上海源叶生物科技有限公司；氧化槐果碱对照品(批号JZ20140508)，购自南京景竹生物科技有限公司，对照品质量分数均不小于98%；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Wondersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值为3.0)(7∶93)[9]；流速为0.8 mL·min-1；柱温为25 ℃；检测波长为220 nm；进样量为10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制成含苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱质量浓度分别为370.0，137.6，75.8 和112.8 μg·mL-1的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.2.2供试品溶液 按照处方比例，精密称定银屑配方颗粒1 g，置于25 mL量瓶中，加入5 mL氯仿和1 mL氨水，超声17 min，取出，放冷，用氯仿稀释至刻度，摇匀，吸取上清液4 mL，用甲醇稀释至10 mL[10]。用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.2.3阴性样品溶液 取不含苦参和山豆根的其余银屑配方颗粒，按照2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.3星点设计-响应面法实验优选供试品超声前处理条件 课题组前期采用单因素实验设计考察了超声功率、超声时间、超声温度和料液比对4种生物碱的峰面积和的影响，发现超声功率和超声温度对优选指标影响较小，可设定为固定因素，其水平分别固定为100 W、40 ℃，而超声时间及料液比对优选指标影响较大。因此，采用星点设计-响应面法实验优选供试品超声前处理条件，将超声时间及料液比按照星点设计的要求进行因素水平的编码，因素水平见表1，实验结果见表2，方差分析见表3。料液比(A)和超声时间(B)对峰面积和的响应面三维图见图1。

表1实验的因素水平

Tab.1 Factors and levels of expert

因素水平-1.414-10+1+1.414料液比1∶41∶5.21∶81∶10.81∶12超声时间/min1017.33552.760

图1料液比、超声时间对峰面积和的效应面三维图

Fig.1 Three-dimensional graph of the ratio of solid to liquid and ultrasonic time to sum of peak area

应用Design Expert V8.0.6.1软件对表2的实验结果进行方差分析和多元二次回归拟合，得到回归方程：y=332 800-24 948.35A-5 035.91B+12 412.50AB+13 284.06A2+3 681.69B2，方差分析结果见表3。由表3可知，此模型极显著(P<0.000 1)，模型的r=0.999 18，调整r=0.985 9，说明此模型可以解释98.37%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合较好，实验误差较小。失拟项P>0.05，不显著，可认为无失拟因素存在，回归模型显著，能够较好地描述实验结果。应用Design Expert V8.0.6.1软件对优选的含量测定条件进行预测，A=5.2，B=17.3，峰面积和的预测值为365 557。

根据实验可操作性将优选的含量测定条件设定为：料液比为1∶5，超声时间为17 min。根据此优选条件制备供试品，按照2.1项下色谱条件进样分析，所得峰面积和为361 476±476，RSD值为0.19%，结果表明，该前处理方法可较好地提取样品中的目标成分。

表2星点设计实验结果

Tab.2 Results of central composite design

编号料液比超声时间苦参碱槐果碱氧化槐果碱氧化苦参碱峰面积和1-1+1136 37949 99472 78668 622327 7812-1.4140158 18569 87159 54857 659345 2633-1-1150 70563 52279 14169 089362 457400116 17853 52984 96373 315327 9855+1+1113 81849 97486 33657 524306 55260-1.414135 82657 22885 05470 365348 473700120 44450 76881 02376 364328 599800126 52650 65388 50573 127338 8119+1.414083 31039 58884 97161 395269 26410+1-1111 48440 16883 12956 797291 5781100125 21452 73183 74572 173333 863120+1.414133 16455 82278 21766 714333 9171300117 80554 15585 09277 505334 557

表3拟合回归方程的方差分析结果

Tab.3 Variance analysis results of fitting regression equation

项目离均差平方和离散系数均方FP模型7.234×10951.447×10984.43<0.000 1A4.979×10914.979×109290.61<0.000 1B2.029×10812.029×10811.840.010 8AB6.163×10816.163×10835.970.000 5A21.228×10911.228×10971.64<0.000 1B29.429×10719.429×1075.500.051 4残差1.199×10871.713×107失拟项3.877×10731.292×1070.640.629 7误差8.117×10742.029×107总离差7.354×10912模型的确定系数0.983 7模型的调整确定系数0.972 0

2.4外标一点法(ESM)的方法学考察

2.4.1专属性实验 将2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液分别进行HPLC分析，见图2。结果表明，供试品溶液中的其他成分对4种生物碱的含量测定无影响，分离度均大于1.5，理论塔板数在2 000以上。

2.4.2线性关系考察 将2.2.1项下制备的混合对照品溶液进行倍量稀释，按照2.1项下色谱条件进样分析。以峰面积对对照品质量浓度进行回归，得到线性方程，见表4。

表44种成分的回归方程和线性范围

Tab.4 Regression equations and linear ranges of 4 constituents

成分回归方程r质量浓度范围/μg·mL-1苦参碱y=7 422.3x+7 635.10.999 82.832 8～362.20槐果碱y=17 539x+1 522.80.999 91.053 5～134.85氧化槐果碱y=10 764x-4 722.80.999 80.580 3～74.28氧化苦参碱y=7 773.5x-5 470.40.999 80.863 6～110.54

图2HPLC图

A.混合对照品；B.样品；C.阴性样品；1.苦参碱；2.槐果碱；3.氧化槐果碱；4.氧化苦参碱。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed standards；B.samples；C.negative samples；1.ma-trine；2.sophocarpine；3.oxysophocarpine；4.oxymatrine.

2.4.3精密度考察 制备1份供试品溶液，连续进样6次，苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱4种化学成分的峰面积RSD值分别为0.80%，1.29%，0.58%和1.74%，结果表明，仪器精密度良好。

2.4.4稳定性考察 制备1份供试品溶液，分别在0，4，6，12，16 和24 h测定。按照2.1项下色谱条件进行测定，苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱4种化学成分的峰面积RSD值分别为1.95%，1.93%，0.71%和1.63%。结果表明，该供试品溶液在24 h内较稳定。

2.4.5重复性实验 取同一批号银屑配方颗粒，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行分析，测得苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱4种化学成分含量的RSD值分别为2.67%，3.88%，2.05%和1.79%，结果表明，该方法重复性良好。

2.4.6加样回收率考察 按照银屑配方颗粒处方比例，精密称取银屑配方颗粒6份，每份1 g，分别加入苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱对照品溶液适量。按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，加样回收率实验结果见表5。结果表明，该方法准确度良好。

2.4.7耐用性考察 对不同柱温(20，25，30和40 ℃)，流速(0.6，0.8和1.0 mL·min-1)，检测波长(215，220和225 nm)以及pH值(2.98，3.00和3.02)进行考察。结果表明，柱温高于30 ℃时，槐果碱分离度小于1.5，表明柱温对槐果碱的含量测定有影响，因此色谱柱柱温应控制在20～30 ℃之间。流速为0.6 mL·min-1时，色谱峰对称性极差，流速为1 mL·min-1时，槐果碱分离度小于1.5，故选择流速为0.8 mL·min-1。检测波长为220 nm时，各峰的分离度更好，基线更稳定，灵敏度更好，因此确定检测波长为220 nm。在不同pH值磷酸盐缓冲液条件下，各峰的分离度、对称性无差别，提示在pH值为2.98～3.02磷酸盐缓冲液条件下，均不影响4种生物碱的含量测定。见表5。

表5加样回收率实验结果

Tab.5 Results of recovery test

化学成分称样量/g样品含量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%苦参碱1.043 3963.9906.21 837.996.498.73.381.042 9963.5906.21 832.695.91.043 2963.8906.21 870.1100.01.043 2963.8906.21 895.7102.81.043 2963.8906.21 822.494.71.043 4964.0906.21 884.3101.5槐果碱1.043 3166.0153.7319.9100.2100.82.871.042 9165.9153.7316.097.71.043 2165.9 153.7323.3102.41.043 2165.9153.7321.4101.11.043 2165.9153.7314.796.81.043 4166.0153.7311.995.0氧化槐果碱1.043 3448.0430.0871.5898.599.92.281.042 9447.8430.0874.6499.31.043 2448.0430.0888.09102.41.043 2448.0430.0877.4199.91.043 2448.0430.0862.9796.51.043 4448.0430.0888.19102.4氧化苦参碱1.043 3573.8557.51 152.7103.8101.02.901.042 9573.6557.51 112.196.61.043 2573.8557.51 133.4100.41.043 2573.8557.51 152.2103.81.043 2573.8557.51 145.5102.51.043 4573.9557.51 124.598.8

2.5一测多评法(QAMS)的建立 将2.2.2项下制备的混合对照品溶液按照2.1项下色谱条件进样。以苦参碱为内参物，由相对校正因子计算公式fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)(其中Ai和Ci分别为待测组分的峰面积和质量浓度，As和Cs分别为内参物的峰面积和质量浓度)计算相对校正因子，同时计算相对保留值(RRT)和保留时间差(Δti/s)。计算公式为RRT=ti/ts，Δti/s=ti-ts(其中ti为待测组分保留时间，ts为内参物的保留时间)[12-14]，见表6。

表6以苦参碱为参照的fi/s(多点校正法)

Tab.6fi/swith matrine as reference (multi-point correction method)

进样体积/μL其他成分相对于苦参碱的fi/s槐果碱氧化槐果碱氧化苦参碱其他成分相对于苦参碱的RRT槐果碱氧化槐果碱氧化苦参碱其他成分相对于苦参碱的Δti/s槐果碱氧化槐果碱氧化苦参碱22.1261.3510.9341.3581.9612.2036.7418.1022.6642.0581.3670.9291.3581.9632.2086.7018.0222.6052.1081.3670.9261.3591.9702.2136.6918.0722.6062.0981.3680.9361.3631.9732.2216.7518.0822.6982.0901.3690.9321.3581.9732.2206.6418.0522.64102.0431.3700.9321.3581.9632.2106.6617.9422.54平均值2.0871.3650.9311.3591.9672.2136.6918.0422.62RSD/%1.5100.5300.4100.1500.2600.3200.620.330.24

2.6一测多评法与外标法测定结果比较 按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，测定结果分别按照ESM和QAMS评价，验证QAMS是否适用于测定银屑配方颗粒中4种生物碱的含量。结果表明，外标一点法和一测多评法结果相对误差较小(均小于2%)[15-16]，可用于银屑配方颗粒中4种生物碱的含量测定。结果见表7。

表7外标一点法和一测多评法的含量测定结果比较

Tab.7 Comparison of assay results between ESM and QAMS methods

编号苦参碱ESM槐果碱/μg·g-1ESMQAMSRE/%氧化槐果碱/μg·g-1ESMQAMSRE/%氧化苦参碱/μg·g-1ESMQAMSRE/%1931.97173.39171.481.10432.42425.141.68544.72548.540.702890.42162.47160.081.47421.87414.851.66539.62541.300.313947.82167.29164.831.48441.67434.521.62559.45565.161.024945.34163.78160.931.74418.93410.781.94543.40547.580.775931.50157.84154.612.04425.41417.801.79549.02553.180.766896.33170.45168.481.16436.01429.581.48564.61568.880.76平均含量/μg·g-1923.90173.39171.481.10429.39422.111.70550.14554.110.72

3 讨论

3.1流动相种类的选择 实验考察了甲醇-25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(7∶93)、甲醇-2 mL·L-1三乙胺(45∶55)[17]、甲醇-0.5 mL·L-1三乙胺(70∶30)[18]、乙腈-磷酸盐缓冲液(3∶97)[19]、乙腈-1 mL·L-1磷酸(用三乙胺调节pH值至8.0)(18∶82)[20]等不同流动相，结果表明，在甲醇-25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液比例为7∶93的流动相条件下，4种生物碱分离度更佳。

3.2流动相比例的选择 分别考察甲醇-25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液比例为7∶93和10∶90的色谱行为，结果表明，甲醇-磷酸盐缓冲液比例为7∶93时4种生物碱的分离度更好。实验中还发现45 min内4种生物碱均被洗脱下来，但在该等度条件下125 min会出现拖尾严重的色谱峰，为避免对后续测定产生干扰并节约测定时间，43 min后用梯度洗脱法(43～48 min 93%～68%B，48～53 min 68%～45%B，53～58 min 45%B，58～68 min 45%～93%B，68～75 min 93%B)将该物质洗脱出来，分析各样品只需75 min。

3.3关于本测定方法精密度与准确度的考虑 《中国药典》2015年版四部所收载的药品质量标准分析方法验证指导原则(通则9101)提出，对于含量为0.01%的待测定成分，其重复性和加样回收率的RSD值小于4%，对于含量为0.1%的待测成分，其重复性和加样回收率的RSD值小于3%即可。本文样品中4种生物碱含量均在0.01%～0.1%之间，因此，参照药典相关规定，提示本法的重复性与准确度在方法学考察可接受范围内。

3.4供试品前处理溶剂的选择 称取适量银屑配方颗粒，置于锥形瓶中，用氯仿-氨水超声提取，放冷，减压回收至近干，用乙腈复溶。色谱结果显示只有氧化苦参碱分离度较佳。

称取适量银屑配方颗粒，置于锥形瓶中，密闭瓶塞，分别用甲醇、甲醇-氨水超声提取，放冷至室温，用甲醇补足减失的质量。结果显示，二者提取的物质成分复杂，干扰色谱峰极多，无法实现4种生物碱的有效分离。

3.5一测多评法的评价 苦参碱价廉易得，且在银屑配方颗粒中含量最高，本研究以苦参碱为内参，用测得的相对校正因子计算其余3种成分的含量，结果准确可靠，为后续测定银屑配方颗粒中4种生物碱的含量提供了依据。利用相对保留值和保留时间差均可对4种生物碱定位。