榄香烯对人卵巢癌SKOV3细胞株生物学作用机制

关永红,唐 艳,董全宇,刘贤英

(吉林大学第二医院,吉林 长春130041)

卵巢癌为三大妇科恶性肿瘤之一。具有发病隐匿，发展迅速，转移及侵袭能力强，恶性度高的特点[1]。早期诊断率低，大部分患者确诊时已是晚期。失去了手术治疗的可行性，只能通过辅助治疗延长其生存期。近年来随着肿瘤细胞学的发展和大量靶向药物的临床应用。从细胞学水平预测治疗方式的有效性和药物敏感性不仅成为可能，而且成为必然趋势[2]因此本研究依SKOV3细胞为靶点，探讨其对榄香烯制剂的生物学机制，为卵巢癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料、细胞，药物及试剂

卵巢癌细胞株(SKOV3)购于中国科学院上海细胞生物研究所；榄香烯注射液由大连金港制药有限公司生产，细胞培养板，RPMI1640培养基，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购于美国sigma公司，胎牛血清购于长春生物制品研究所)

1.2方法

1.2.1细胞培养、分组与给药 人卵巢癌SKOV3细胞株经复苏后置于含有10%胎牛血清的1640培养基内于37°C 5%二氧化碳培养箱内静止培养，取对数生长期的SKOV3细胞进行下一步实验。0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞数为5×104/ml，加入96孔塑料培养板内每孔100 μl/孔分为空白对照组、实验组(榄香烯浓度为100,200,400 μg/ml)

1.2.2细胞增殖抑制率检测(MTT试验) 取96孔培养板内生长良好SKOV3细胞分组，空白对照组，只加入100 μl细胞维持液，共10复孔，实验组分别加入由细胞维持液配制的不同浓度的榄香烯溶液，每个浓度10复孔，于5%二氧化碳培养箱内静止培养，结束前4小时每孔内分别加入MTT试剂20 μl，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔内分别加入二甲基亚砜(DMSO)200 μl震荡10 min，应用酶标仪于570 nm处测定吸光度A值，计算各组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100%，结果见表1。

表1 不同浓度榄香烯制剂对SKOV3细胞增殖抑制率

1.2.3SKOV3细胞周期进程及凋亡率检测 细胞培养及分组同1.2.2，不同之处是将96孔培养板改为25 ml培养瓶进行。每个浓度5瓶培养结束后，收集细胞，PBS(磷酸盐缓冲液)洗3次。70%乙醇固定，置4℃冰箱内48 h后取出离心1 000 r/5 min，碘化丙啶漂色，避光孵育30 min，然后通过流式细胞仪检测，采用CELL QUEST软件分析各组细胞周期各时相变化及凋亡率，结果见表2。

1.2.4透射电子显微镜观察 细胞培养及分组同1.2.3 实验结束后分别收集经不同浓度榄香烯制剂作用后的SKOV3细胞悬液于锥型离心管内离心沉淀1 000 r/10 min，弃去上清，细胞沉淀物经2.5%戌二醛前固定。1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅一铀双重染色，透射电子显微镜观察。

2 结果

2.1MTT结果不同浓度的榄香烯制剂对 SKOV3细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义P<0.01。

2.2流式细胞仪结果不同浓度的榄香烯制剂作用于SKOV3细胞后G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M细胞相对增多，细胞凋亡率升高，组间比较有统计学意义，提示榄香烯制剂能够阻滞SKOV3细胞周期进程改变，及诱导细胞凋亡率增高。

表2 不同浓度榄香烯制剂对SKOV3细胞周期进程改变及凋亡率

2.3透射电子显微镜结果不同浓度榄香烯制剂作用SKOV3细胞后，细胞膜破裂，线粒体肿胀，细胞核染色质凝集，可见凋亡小体改变，微管，微丝断裂，胞浆内有空泡形成，见图1-3。

图1 100μg/ml榄香烯对SKOV3细胞 改变，线粒体肿胀，有空泡形成5000×图2 200 μg/ml榄香烯对SKOV3细胞改变，细胞膜破裂，核染体凝集5000×图3 400 μg/ml榄香烯对SKOV3细胞改变，细胞核破碎，可见凋亡小体5000×

3 讨论

卵巢癌早期诊断困难单纯手术切除治愈率较低，目前采取手术为主.放疗化疗为辅的综合治疗。然而.由于传统的化疗药物存在不同程度的不良反应.在损伤肿瘤细胞的同时对正常器官和组织也有明显的损伤。因此、寻找不良反应小或无不良反应的药物成为目前卵巢癌治疗的新热点。榄香烯是从草本植物中药莪术中提取的一种挥发油类物质[3]，研究证明该物质具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂.抗突变等多种生物学作用.而且毒副作用小，获取方便，广泛用于呼吸系统、消化系统、妇科系统肿瘤的治疗、尤其是肿瘤所致的胸腔、腹腔积液.治疗效果显著。因此，本研究应用榄香烯制剂，体外观察对SKOV3细胞增殖抑制作用及细胞周期进程，细胞凋亡及亚细胞结构改变。MTT.结果表明，不同浓度的榄香烯制剂对SKOV3细胞的增殖抑制作用均获得了较为满意结果，抑制率分别为16.2% 37.8%和45.6.%与对照组相比，差异有统计学意义。P<0.01。MTT 试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶吸收，将MTT试剂还原成蓝色甲臜颗粒。且甲臜生成量与活细胞数及细胞活化状态呈线性关系。因此MTT试验被广泛用于抗肿瘤药物筛选和细胞毒性试验研究。具有一定的客观性。

流式细胞术结果显示，不同浓度的榄香烯制剂对SKOV3细胞增殖周期各时相均有不同程度的抑制作用，细胞周期是一个高度保守备受各种细胞因子严格控制[4].任何一个环节失控即可发生功能和形态学改变，榄香烯诱导SKOV3细胞具有一定的浓度依赖性、均表现出G0/G1期细胞增多。S期细胞减少。从而使G2/M期细胞相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应，这一现象从细胞凋亡率得到了证实。凋亡率分别为9.6%，16.9%和19.2%。文献报道[5]。在肿瘤治疗中，细胞周期阻滞对于减缓肿瘤的生长.提高治疗的效率尤为重要。由于肿瘤细胞多发生P53基因突变从而缺泛G1期检查点、而G1期检查点是各种化学药物作用的敏感点。榄香烯制剂恰巧使skov3细胞G1期检查点阻滞.从而使肿瘤细胞增长变缓。不能进入S期。G2/M期作为细胞进入有丝分裂之前的最后一道关卡、多种治疗手段都会使肿瘤细胞具有选择性停止该期[6]且有作为新型肿瘤治疗靶点的可能性。

此外.本研究还应用透射电子显微镜观察经不同浓度的榄香烯制剂作用后的SKOV3细胞亚细胞结构改变.细胞器线粒体肿胀，有空泡形成.核染色质趋边凝集.纺锤体断裂.可见凋亡小体改变。

综上所述.榄香烯诱导SKOV3细胞具有一定的浓度依赖性、因此、研究细胞周期阻滞机制不仅对基础细胞生物学有重要的理论价值，也对预防和治疗肿瘤有重要的指导意义。为了提高榄香烯的抗癌效果，同时减轻不良反应，探索新的药物剂型、在降低毒性的基础上，通过增加剂量、延长作用时间，以期达到提高疗效及临床顺应性的目的。