沙眼衣原体LpxA蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

李德坤，余锦强，邵 杰，汪 艳，刘珍凯，周贵春，穆迎涛

(湖北医药学院附属人民医院 眼科·十堰市人民医院 眼科中心，湖北 十堰442000)

沙眼感染性致盲的主要因素之一。随着卫生条件的改善，目前发达国家及地区沙眼的发病率已经非常低，但是在我国以及亚州、非州和拉丁美洲等一些落后地区沙眼患者的数量依旧仍旧居高不下[1,2]。沙眼的病原菌是沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)，Ct是一种具有独特二相发育周期、细胞内寄生的革兰阴性细菌[3,4]。调查发现A、B和C等血清型Ct极其容易感染眼部，从而导致沙眼，D-K型容易感染泌尿生殖道，导致尿道炎、盆腔炎和阴道炎等疾病，开展Ct的致病机制研究具有重要的现实意义[5]。

已有研究证实Ct的质粒蛋白、热休克蛋白、主要外膜蛋白，和III型分泌蛋白等多种蛋白都可能参与了致病过程[6-8]。研究发现Ct与其他革兰阴性细菌一样，其外膜也含有大量的糖脂(Lipopolysaccharide，LPS)和脂蛋白。LPS一般是由脂质A、O-抗原和核心区所组成。LPS具有活化补体和刺激机体释放血管活性物质等作用，在细菌的粘附和侵袭过程中起重要功能[9,10]。细菌LPS的合成途径十分复杂，如大肠杆菌能利用LpxA(UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase，LpxA)蛋白催化O-酰基加入到尿苷5′-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，这个催化反应是脂质A合成途径的第一步[11]。目前衣原体LPS的合成途径尚缺乏研究，我们在前期扩增得到Ct LpxA基因。本文拟通过基因工程的方法纯化得到His-LpxA蛋白，然后将其免疫新西兰兔，获得了抗His-LpxA蛋白的血清，为进一步研究Ct LPS的合成途径提供实验基础。

1 材料与方法

1.1菌种、载体和实验动物

大肠杆菌DH5α、BL21、含LpxA基因的重组质粒pMD18-LpxA，原核表达载体pET28a都由湖北医药学院保存，实验用动物新西兰兔购自广东省医学实验动物中心。

1.2主要试剂和仪器

胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、ExTaq酶、限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶及均购自大连Takara公司，BCA蛋白定量试剂盒购自北京百泰克公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自美国 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc公司，ECL发光剂购自英国Amersham，弗氏佐剂购自Sigma公司产品。Ni2+层析凝胶购自北京康为世纪生物科技有限公司；冷冻高速离心机(Microfuge 20R)购自美国贝克尔曼；超声波破碎仪(scientz-950E)购自宁波新芝、超低温冰箱和PCR仪购自赛默飞世尔公司；半干电转印仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3引物设计及合成

根据LpxA基因序列，使用primer primer6软件设计引物，上游引物序列为：5′-CCCATATGACCAACATTCATCCTACA-3′(下划线为NdeⅠ酶切位点)和下游引物序列为：LpxA-R:5′-TTCTCGAGTTACTAAGACTCAACGAAAGCTCCT- 3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)。

1.4LpxA基因的扩增及回收

以重组质粒pMD18-LpxA为PCR模板，扩增目的基因，PCR程序为：94 ℃，5 min；(94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min)* 35个循环；72 ℃，5 min，然后用琼脂糖凝胶电泳将PCR产物电泳，回收目的DNA片段。

1.5重组表达质粒的构建

将pET28a空质粒和LpxA基因进行双酶切，回收。然后使用T4 DNA连接酶将LpxA和pET28a在16 ℃下过夜连接。将连接产物转化大肠埃希菌DH5α，37 ℃倒置，培养16 h。挑取阳性单菌落到LB液体培养基中培养12 h，提取质粒使用PCR验证，将PCR呈阳性的细菌送上海生工公司进行测序验证。

1.6重组蛋白的诱导表达与纯化

将pET28a-LpxA转化大肠埃希菌BL21。第二天挑阳性菌接种到LB培养基培养过夜，然后将其按照1∶100扩接到新LB液体培养基；当细菌长到OD600约为0.6时，加入0.1 mmol/L IPTG到培养液，置于28 ℃培养，诱导细菌表达重组His-LpxA蛋白，培养4 h后收集细菌。利用pH值为7.4的PBS溶液洗涤，然后在冰上进行超声破碎。使用12 000 r/min离心20 min，取上清加入Ni2+层析凝胶，孵育1 h，然后使用40 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，最后用250 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白并收集，使用SDS-PAGE检测纯化效果。

1.7兔抗His-LpxA蛋白多抗的制备

将纯化好的His-LpxA蛋白与完全弗氏佐剂乳化，背部皮下多点注射接种新西兰兔，每只兔接种200 μg，接种3只。三星期后，将His-LpxA蛋白与弗氏不完全佐剂乳化，然后每只兔背部皮下接种200 μg，进行第二次免疫。第三，四次免疫方法和步骤与第二次相同。同时设置注射生理盐水组为阴性对照。最后一次免疫2个星期后心脏处死采血，分离血清并将其保存在-20 ℃冰箱备用。

1.8抗血清的特异性和效价检测

取纯化好的His-LpxA进行 SDS-PAGE凝胶电泳，然后以100 V恒电压将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，加入致备好的抗血清，4 ℃孵育过夜，洗涤干净。加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，洗涤干净后加入加底物进行显色，显影后观察结果。

将150 ng的His-LpxA蛋白包被到96孔板，4 ℃包被过夜。加入封闭液封闭2 h。将血清进行1∶40，1∶80，1∶160，1∶320……1∶40 960倍比稀释，然后每孔加入100 μl，以未免疫血清为阴性对照，同时设置PBS溶液为空白对照。室温孵育2 h，洗涤干净后加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，室温孵育反应2 h。加入显色剂显色，10 min后加入终止液终止反应，并测定其OD450，计算血清效价。

2 结果

2.1表达载体的构建

以pMD18-LpxA为PCR为模板，PCR扩增得到的Ct LpxA基因大小为840 bp(图1A)，与理论大小相符。将其连接到pET28a载体获得重组质粒pET28a-LpxA，使用PCR检测pET28a-LpxA，也得到与LpxA基因理论分子量大小相同的条带(图1B)。测序结果显示其序列与LpxA基因一致，表明成功构建重组质粒pET28a-LpxA。

注:M:Marker; 1,2:LpxA基因扩增产物

2.2His-LpxA蛋白的表达及纯化

将重组质粒pET28a-LpxA转化到大肠杆菌表达菌BL21，培养后使用0.1 mmol/L IPTG诱导His-LpxA融合蛋白表达。电泳后发现与对照相比，重组菌在32.8kDa左右有蛋白表达，与His-LpxA蛋白的理论分子量一致(图2，泳道2)。经Ni2+层析柱纯化得到LpxA蛋白，其纯度约为95%(图2，泳道3)。

注：M：蛋白marker；1：转化pET28a的诱导产物；2：重组菌BL21/ pET28a-LpxA 的诱导产物：3：经Ni2+层析柱纯化后的His-LpxA蛋白

2.3制备的多克隆抗体可识别His-LpxA蛋白如图3所示，制备的多克隆抗体能够识别重组His-LpxA蛋白。

图3 制备的多克隆抗体能识别His-LpxA蛋白

2.4LpxA抗血清效价如图4所示，使用ELISA测定对照组和免疫组新西兰兔血清多克隆抗体的滴度，4次免疫后，将实验组血清血清稀释10 240倍后为阳性(图4)，表明获得血清的滴度大于1∶10 240，成功制备抗血清。

图4 ELISA检测LpxA蛋白免疫新西兰兔后血清

3 讨论

LPS是革兰阴性细菌的毒力因子之一，对大多数的革兰阴性细菌的活性极为重要，研究发现革兰阴性细菌中至少有6个基因参与了脂质A的合成，抑制其中任一基因的活性都会导致细菌的死亡[9]。Ct感染能够导致沙眼和生殖道等多种疾病 近年来研究证实LPS是Ct的EB发育过程中必不可少的成分，如果抑制Ct脂质A合成酶的活性，阻止Ct合成LPS，会导致具有感染活性的EB会失去感染能力[10,12]。LpxA基因是催化合成脂质A的第一个关键基因，它能够将O-酰基转移到尿苷5'-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖。现在针对细菌的LpxA蛋白开发新型抗生素，LpxA蛋白有望成为控制Ct传染的靶点之一[11,13,14]。

获得高纯度的LpxA蛋白为研究Ct中脂质A合成途径提供实验基础。His标签具有分子量小，免疫原性低和与Ni2+亲和力高等特点，现在广泛用于纯化外源融合蛋白[15]。本研究将LpxA基因连接到pET28质粒，得到的重组质粒能够表达含His标签的融合蛋白。将重组质粒转化到表达菌大肠杆菌BL21，使用IPTG诱导大肠杆菌表达融合蛋白，然后我们再用Ni2+亲和法对纯化目的蛋白，得到较好纯度的融合蛋白。我们使用纯化得到的融合蛋白免疫新西兰兔，得到抗LpxA蛋白的血清，发现其效价高都于1∶10 240，说明纯化得到的融合蛋白能够诱导新西兰兔产生高效价的抗体，为进一步研究LpxA蛋白功能提供基础。