粪便SFRP2基因甲基化与大肠癌的相关性研究

刘 洋

(青海省第五人民医院(青海省肿瘤医院)，青海 西宁810007)

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。目前，大肠癌已成为世界第三大常见肿瘤，西方发达国家的大肠癌病死率居全部恶性肿瘤第二位，在我国居第四位。Wnt信号通路异常是大肠癌发生发展的早期改变，在这个改变过程中，肿瘤细胞不同与正常环境而生长、增殖，同时肿瘤细胞的凋亡数量也减少[1]。作为Wnt信号通路中至关重要的负调节蛋白，SFRPs可能在大肠癌发生发展过程中有重大的意义[2,3]。本研究采用PCR与凝胶电泳的方法测定大肠癌患者SFRP2基因的甲基化状况，分析结果并探讨其是否有望成为大肠癌筛查的重要指标。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年1月至2016年12月于我院就诊的大肠癌患者40例，患者的检查结果已通过病理检查确诊，病例纳入标准：(1)患者诊断为单一部位肿瘤；(2)患者诊断为首次确诊，非复发、转移；(3)标本采集前未行药物治疗和其他可能影响结果的肠道检查。大肠癌患者作为观察组，以健康志愿者作为对照组。大肠癌患者40人，其中男24人，女16人，年龄62-75岁，平均年龄69.03±5.12岁；健康志愿者40人，其中男25人，女15人，年龄62-74岁，平均年龄68.81±5.16岁。经统计学分析，两组研究对象的一般情况，如年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有良好的可比性。

1.2方法

医护人员指导患者和志愿者正确收集粪便标本，标本采集后由专人送至实验室，根据实验需要分装后置于零下80℃的冰箱冰冻保存。

1.2.1DNA的提取与纯化 采用天根生化科技(北京)有限公司生产的粪便DNA基因组提取试剂盒，按说明书进行操作提取粪便DNA基因组，采用紫外分光光度计检测提取与纯化得到的DNA片段的浓度与纯度。

1.2.2DNA的亚硫酸氢钠修饰 采用北京天漠科技开发有限公司生产的DNA甲基化试剂盒，按说明书进行操作，完成DNA的亚硫酸氢钠修饰。

1.2.3PCR反应 引物合成：采用针对甲基化和非甲基化序列的引物，由上海英拜生物科技有限公司合成，见表1。

表1 甲基化和非甲基化序列引物

PCR反应条件：反应体系：包括PCR缓冲液5 μl，2.5 mmol/LdNTP4 μl，甲基化上下游引物和非甲基化上下游引物各1 μl，甲基化模板DNA5 μl，Taq酶0.25 μl，加水至总体积50 μl。循环条件：先95℃预变性10 min，然后以95℃变性30 sec，55℃退火30 sec,72℃终末延伸60 sec的循环条件作35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4琼脂糖凝胶电泳 取扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳试验，琼脂糖凝胶浓度2%，电压75 V，45 min。

1.3观察指标查看琼脂糖凝胶电泳试验结果，以阳性对照为标准，出现阳性条带者为判断为阳性，统计并记录阳性例数。

1.4统计学方法采用统计软件SPSS19.0对研究结果中的各项数据进行分析，定性资料采用卡方计数检验法，检验水准取α=0.05，以P<0.05作为具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1大肠癌患者与健康志愿者粪便SFRP2基因甲基化的凝胶电泳结果对比:大肠癌患者粪便标本可见SFRP2基因甲基化，几乎所有健康志愿者粪便标本未见SFRP2基因甲基化，见图1。

图1 大肠癌患者与健康志愿者粪便SFRP2基因甲基化的凝胶电泳结果

2.2大肠癌患者与健康志愿者粪便SFRP2基因甲基化例数的统计学分析:大肠癌患者中出现甲基化的比率为80.00%(32/40)，健康志愿者出现甲基化的比率为7.5%(3/40)。与健康志愿者相比，大肠癌患者中出现甲基化的比率大大升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组对象粪便标本甲基化情况比较

3 讨论

近年来，在世界多数国家，大肠癌的发病率逐渐上升。大肠癌早期无症状或症状不明显，癌瘤生长速度缓慢，在其达到机体出现明显症状、体征之前要经过相当长的时间，故临床前来就诊的患者往往癌肿已到晚期[4,5]。早期诊断对于提高大肠癌患者生存率以及改善大肠癌患者生活质量至关重要。目前临床常用的检测手段为大肠内镜检测、钡餐造影等检查，但是这些传统检测因检查过程繁琐、有创、费时等因素而不适合推广使用。临床常用的筛查方法还包括大便隐血试验和癌胚抗原(CEA)检测等，这些筛查方法虽然无创，但是敏感性以及特异性较差，临床应用价值不高[6]。因此，全球癌症工作者都着手于寻求一种更新的大肠癌检测手段，能具有简便、无创、可靠等优点。由于具备诸多优点，粪便DNA检测已逐渐成为近年来各个国家癌症工作者检测大肠癌研究的热点[7]。

近期的研究显示，表观遗传学改变，尤其是DNA甲基化的改变在大肠癌的发生发展过程中起着重要的作用，DNA甲基化变化被认为是结直肠癌发生的一个关键机制。人类有五种sFRP基因，分别为sFRP1基因、sFRP2基因、sFRP3基因、sFRP4基因、sFRP5基因，其中sFRP2基因作为作为Wnt信号通路中至关重要的负调节蛋白，通过使基因沉默的作用，其甲基化改变成为大肠癌一个重要特征。在人体发育的过程中，Wnt信号通路主要在细胞的生长、运动和分化过程中发挥作用，器官和组织成熟后，Wnt信号通路也有助于其内环境稳定。Wnt信号通路异常是大肠癌发生发展的早期改变，在这个改变过程中，肿瘤细胞不同与正常环境而生长、增殖，同时肿瘤细胞的凋亡数量也减少。分泌型卷曲相关蛋白是Wnt信号通路的拮抗物，其含有一个特有的半胱氨酸富含域(CRD)，同Wnt信号的FZ型受体的CRD同源。SFRPs可以使Wnt信号通路受阻，可能的途径为：(1)与Wnt信号蛋白质相互竞争以阻止它们与FZ型蛋白结合；(2)与FZ型受体形成无功能的复合物，减少FZ型受体复合物对机体的实际作用。SREPs基因甲基化后，阻碍作用下调，Wnt信号通路激活，持续作用于大肠癌发生发展的全过程，肿瘤细胞不断生长、增殖。因此，作为Wnt信号通路中至关重要的负调节蛋白，SFRPs可能在大肠癌发生发展过程中有重大的意义。

粪便DNA检测是近年来全球大肠癌检测研究的热点方向。正常肠道黏膜细胞在生长、增殖的同时，也有大量细胞更新脱落进入肠腔，随着粪便排出体外。这提示，在粪便可能存在与癌症和癌症细胞相关的化学物质和基因。而癌细胞的增殖代谢相较于正常肠道粘膜细胞更加旺盛，只要使用DNA提取技术将粪便中的DNA提取出来，使用PCR扩增技术扩增相关突变基因，在采用凝胶电泳方法分析产物，就可能达到通过粪便诊断大肠癌的目的[8,9]。本研究分析了大肠癌患者粪便样本中SFRP2甲基化状态。结果表明，大肠癌患者中出现甲基化的比率为80.00%(32/40)，健康志愿者出现甲基化的比率为7.50%(3/40)。与健康志愿者相比，大肠癌患者中出现甲基化的比率大大升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究采用亚硫酸盐处理基因组DNA使其发生甲基化状态依赖的序列改变，然后进行PCR反应，扩增待检测的DNA区域。扩增片段中原先未被甲基化的胞嘧啶位点上发生胞嘧啶转变为胸腺嘧啶的改变，而原先被甲基化的胞嘧啶位点则保持不变。与其他甲基化检测技术比较，具有以下特点[10,11]：(1)检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1 μg的基因组DNA。(2)检测结果更为直观。(3)可定量检测靶位点甲基化水平。(4)结果可信，出现假阳性的概率很小。

综上所述，SFRP2基因的甲基化改变是筛选大肠癌的敏感标志，粪便SFRP2基因甲基化检测有望成为无创诊断大肠癌的新途径。