基因转染建立高表达转化生长因子β1大鼠肝星状细胞的实验研究

周霞 黄效模 张一 曾德珍⋆

肝纤维化的形成机制是一个有众多因素参与复杂的病理过程，肝纤维化实质是慢性肝病损伤修复反应，肝星状细胞（HSC）在肝纤维化过程中起核心作用，各种原因肝损伤时，引起肝脏细胞外基质（ECM）合成增加，降解减少，进而造成肝内ECM不断积聚，最后导致肝纤维化甚至肝硬化。TGFβ1是HSC活化最重要的因子之一［1］，目前大多数抗纤维化研究均以HSC为靶标，2017年3月至12月作者通过实验研究，拟建立高表达TGFβ1的HSC阳性克隆，为肝纤维化的防治提供细胞实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠肝星状细胞株HSC-T6由武汉协和医院胃肠病实验室提供。pcDNA3.1（+）质粒、感受态大肠杆菌DH-5ɑ购自武汉晶赛生物工程技术公司，限制性核酸内切酶 NheI、XbaI、SmaI、Bg1II、EcoRI、T4多聚核苷酸激酶和Taq酶购自TAKARA公司，T4 DNA连接酶购自New England Biolabs，凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司，寡核苷酸DNA单链由上海博亚生物技术有限公司合成。阳离子脂质体Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司，TRIzolTM Reagent 购自Invitrogen公司，新生SD大鼠由同济医科大学实验中心提供。

1.2 方法 （1）质粒构建：根据已知的大鼠TGFβ1基因序列合成目的片段引物：TGFβ1引物： P1：5'-GGAATTCGCCACCATGGGCATGCCGCCCTCGGGG CT-3'，P2：5'-CCGCTCGAGTCAGCTGCACTTGCAGGA GCG-3'。TGF 1两端有EcoRI和XhoI酶切位点。以大鼠cDNA为模板扩增TGFβ1基因中1.2kb的目的基因片段，PCR反应条件为：94℃变性5min进入循环过程，94℃变性20s，60℃下退火25s，72℃延伸75s，循环32次后72℃复性3min，凝胶电泳回收TGFβ1产物，限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切TGFβ1产物回收1.2kb的酶切产物。（2）表达载体构建：TGFβ1酶切产物通过T4连接酶与EcoRI和XhoI酶切的质粒pcDNA3.1（+）连接，转化感受态DH-5ɑ，新霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1（+）-TGFβ1，酶切鉴定成功后，菌液由上海英俊公司进行测序分析。同时，用含绿色荧光蛋白的pcDNA3.1（+）-EGFP为阴性对照质粒。（3）pcDNA3.1（+）-TGFβ1转染HSC及G418的筛选：大鼠肝星状细胞株HSC-T6含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，体积分数为5%CO2孵育箱中培养。转染前1d，将HSC-T6细胞接种于6孔培养板，每孔2×105个细胞，过夜培养后，将构建的质粒转染细胞，操作按脂质体Lipofectamine 2000 转染手册进行。取一试管加入质粒2μg，用250μl Opti-MEM 培养基混合稀释，另一试管加入脂质体Lipofectamine 2000 5μl，用250μl Opti-MEM培养基混合稀释。室温无菌条件下放置5min，两试管混合后放置20min，在6孔板中每孔加入量为500μl混合液培养4h，更换培养液继续培养，48h后计算转染率，并改用含400μg/mlG418培养基，15%FCS的DMEM培养液2ml，6d后细胞大部分凋死，G418浓度减至200μg/ml维持筛选，残存细胞约16d后形成阳性克隆，更换为正常培养液继续培养和传代。并将细胞分为pcDNA3.1（+）-TGFβ1转染组，pcDNA3.1（+）-EGFP转染组，未传代及转染细胞为空白组，正常培养传代21d的空白组细胞为阴性对照组。（4）荧光定量PCR检测TGFβ1mRNA的表达：筛选阳性克隆后，继续培养48h，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，荧光定量PCR法分别扩增TGFβ1mRNA。按定量RT-PCR试剂盒说明取1μg总RNA逆转录合成cDNA，然后以Sybr Green I作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪（Roche公司，德国）上进行PCR反应。PCR引物：TGFβ1：5'-GAGGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游引物 5'-TTGTTGCGGTCCACCATTAGC-3'。反应条件如下：预变性94℃ 3min，50个循环中94℃ 30s，53℃30s，72℃ 30s，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，CT法进行相对定量。（5）Western blot法测定TGF-β1的表达：收集各组细胞，消化后加入预冷的细胞裂解液，置冰上30min，4℃、12000g离心，取上清液进行蛋白分光光度仪定量（考马斯亮兰法），每组取20μg蛋白加热变性后，10%SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉的Tris盐溶液封闭2h，加入1：200稀释的一抗兔抗TGFβ1多克隆抗体，4℃孵育过夜。用含吐温-20的Tris盐溶液洗膜3次，加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温下孵育1h。化学发光法（ECL）检测条带。β-actin作为内参。上述实验均重复3次，并计算机扫描电泳图像。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用（±s）表示，用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pcDNA3.1（+）-TGFβ1用BamHI酶切，经2%琼脂糖凝胶电泳后可见1.2kb的清晰条带，进行测序结果与GenBank所提供的序列完全相同，提示含有TGFβ1基因的pcDNA3.1（+）构建成功。见图1。

图1 重组pcDNA3.1（+）-TGFβ1BamHI单酶切鉴定结果

2.2 脂质体对Lipofectamine 2000对细胞毒性作用的G418筛选 应用转染试剂Lipofectamine 200 pcDNA3.1（+）-TGFβ10转染HSC-T6细胞后镜下观察显示，在5μl的用量下HSC-T6细胞转染前、后的形态和数目与对照组及空白组无明显差异，瞬时转染48h后测得转染率为28.2%。筛选结果显示，G418筛选试剂的最佳浓度为400μg/ml，应用21d后可筛选出稳定表达的细胞克隆，并能进一步培养传代。见图2。

图2 转染48h EGFP的表达

2.3 TGFβ1mRNA的表达情况 荧光定量PCR法检测TGFβ1的mRNA表达，结果显示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1转 染 组 TGFβ1的 mRNA 表 达 较 pcDNA3.1（+）-EGFP质粒转染组、空白组及对照组明显增高［（20.220±0.879）vs（9.609±1.607）vs（5.122±3.512）vs（6.213±0.259），P＜0.05］。

图3 Wester blot 法检测各组TGFβ1蛋白的表达

2.4 TGFβ1蛋白的表达情况 Western blot印迹法检测TGFβ1蛋白表达。TGFβ1在SDS-PAGE凝胶电泳中表现为46KD的条带，实验显示：pcDNA3.1（+）-TGFβ1转染组TGFβ1蛋白的表达较pcDNA3.1（+）-EGFP质粒转染组、空白组及对照组明显增高［（0.968±0.822）vs（0.319±0.083）vs（0.211±0.024）vs（0.250±0.086），P＜0.05］。见图 3。

3 讨论

肝纤维化指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是ECM合成和降解不平衡的结果，是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。早期肝纤维化经治疗可以逆转［2］，因此深入开展肝纤维化形成机制的研究有十分重要的意义。目前认为HSC的激活是肝纤维化形成机制的中心环节。慢性肝损害过程中，大量细胞因子通过介导细胞-细胞间，基质-细胞间相互作用影响HSC，激活并促使HSC大量合成ECM，导致ECM过分沉积出现肝纤维化。在HSC的激活、致纤维化以及与其他细胞的相互作用的过程中，多种因素参与该过程的调节，细胞因子起重要作用，而TGF-β1是激活 HSC 的最重要促进因子［3］。

TGFβ是一种多功能的多肽类细胞因子，几乎体内所有细胞都能分泌TGFβ并存在其受体，在细胞的生长调节中起重要作用。自从1983年TGFβ1及随后其他两个成员TGFβ2、TGFβ3在哺乳类动物中发现，关于TGFβ的研究也越来越引起人们的重视。TGFβ家族是已知与纤维化形成关系最密切的细胞因子［4］，其中，TGFβ1是最重要的致纤维化因子［5］，在肝纤维化发展过程中起重要作用。TGFβ1是启动邻近静息态HSC激活和转化的初始信号之一，Gressner［6］等在肝纤维化形成的3步激活模式中表明TGFβ1的这种初始激活作用，并已被大量研究证实。Kupper细胞、单核细胞、血小板的旁分泌及HSC的自分泌是TGFβ1早期持续增高并使肝纤维化持续发展的重要原因。TGFβ1所介导的信号通道被认为在HSC的活化及ECM的产生起重要作用［7］。

HSC 作为肝纤维化发病的关键环节倍受关注，以HSC 为靶标的治疗措施逐渐成为抗纤维化的重要方法［8］。因此，构建pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表达载体并转染HSC，建立高表达TGFβ1的HSC，模拟肝纤维化过程中TGFβ1高表达的体内环境，并以此为细胞为基础进行下一步研究。本资料表明，pcDNA3.1（+）-TGFβ1真核表达载体构建成功，并可成功转染HSC，转染率为28.2%，48h后加入G418筛选，约21d可形成阳性克隆，经荧光定量PCR及Western blot鉴定，克隆细胞高表达TGFβ1mRNA及蛋白，表明高表达TGFβ1的HSC筛选成功。鉴于HSC在肝纤维化发病机制中的主导作用，可应用高表达TGFβ1的HSC开展肝脏疾病，尤其是肝纤维化、肝硬化的研究，可得到更为可信且直接的实验结果，为肝纤维化的防治提供理论依据。