中华三脊甲生物学特性及进化分析

刘鹏，廖承清，徐家生，郭青云，戴小华,2，钟苗

(1.赣南师范大学生命与环境科学学院潜叶昆虫研究组，江西 赣州 341000;2.国家脐橙工程技术研究中心，江西 赣州 341000)

中华三脊甲Agonitachinensis(Weise)隶属于鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae潜甲亚科Anisoderinae三脊甲属Agonita，该属主要分布于东洋区和非洲区[1]，全世界共有128种[2]，我国有记录22种，主要分布云南、福建、四川、广西等地[1]。三脊甲属幼虫均为潜食性，成虫为外食性，国内仅3种报道其寄主为竹类，虽然陈世骧 等在《中国动物志 昆虫纲 鞘翅目 铁甲科》和《云南生物考查报告》中对中华三脊甲的成虫形态特征和分布进行了详细描述，但对其寄主描述较粗略[1,3]。目前有关该种的幼虫和蛹的生物学方面未见报道。

竹类潜叶害虫丰富，近年来仅潜叶昆虫研究组就采集饲养了3目4科十余种，涵盖双翅目Diptera潜蝇科Agromyzidae，鳞翅目Lipidoptera小潜蛾科Elachistidae、尖蛾科Cosmopterygidae，鞘翅目吉丁科Buprestidae、叶甲科(平脊甲属Agoniella、三脊甲属Agonita、趾铁甲属Dactylispa)等。

中华三脊甲目前已有报道寄主仅有簝竹属(箬竹属Indocalamus)[1]，作者近年陆续发现其寄主远超已报道的类群，除簝竹属外，还寄生于大节竹属大节竹Indosasacrassiflora、刚竹属Phyllostachys、簕竹属Bambusa坭竹Bambusagibba等。大节竹和刚竹属具有很高的观赏性价值，常用于城市园林绿化，刚竹属还是优良的笋用竹，其产值达全国竹类产值的90%以上[4-5]；坭竹常作为耗材，用于围篱、农具、渔具等，还可用于造纸，具有很高的经济意义[6]。中华三脊甲成虫在叶片表面取食，留下明显的条状食痕，幼虫潜食进叶片内部，取食叶肉，形成白色大斑块状潜道，潜食部位基本无光合作用，成虫与幼虫取食叶片均影响叶片美观，降低观赏性，且易造成叶片脱落，影响植株长势，虫害大暴发时全株1/5以上的叶片被危害，造成极大经济损失。研究中华三脊甲的生物学特性可为防治提供一定的理论基础。

目前国内应用分子生物学技术对中华三脊甲种群遗传学、物种间的亲缘关系和系统进化等方面研究较匮乏。作者通过野外采集、实验室饲养等手段，系统研究其生物学特性，结合总DNA提取和COI基因的扩增[7]，对其中细胞色素氧化酶I亚基基因(mtCOI)序列进行分析，研究结果不仅有助于预防其危害，减少危害发生，也可为探讨三脊甲的进化关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 采集被中华三脊甲潜食危害的竹子枝条若干，装入封口塑料袋，依据采集的时间、地点等进行编号。在实验室利用EPSON扫描仪采集寄主植物标本图像和有潜道的叶片图像，对成功羽化的成虫进行记录、拍照、鉴定并制成针插标本，将寄主植物送鉴。标本分别采自江西省龙南县安基山森林公园、龙南县九连山国家自然保护区、贵州省荔波县茂兰国家自然保护区和云南省景洪县西双版纳植物园等地。

1.1.2 生物学习性观察 将有活虫的植物用沾水棉花包住枝条末端，放置实验室饲养，幼虫及蛹分袋饲养，记录各阶段发生时间及持续时间，在体视显微镜下观察、解剖、拍照各虫态的形态特征。

1.1.3 材料处理 在实验室从寄主植物潜道中挑选出一部分老熟幼虫放置-80 ℃冷冻保存；一部分浸泡于无水乙醇中备用；其它老熟幼虫于实验室饲养，收取蛹和成虫浸泡于无水乙醇，放置-80 ℃冷冻保存。共饲养出成虫54只，分别制成标本，应用IPM Scope摄像头和Canon EOS 7D及微距摄像头进行拍照，镜检鉴定为中华三脊甲。检查标本均保存于赣南师范大学生命与环境科学学院(国家脐橙工程技术研究中心)虫害防控实验室。

1.2 总DNA提取及COI基因的扩增和系统发生分析 使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取中华三脊甲的线粒体基因组，采用线粒体COI基因的通用引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)和LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)[8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应体系为50 μL,包括5倍PrimeSTAR Buffer 10 μL，PrimeSTAR酶 0.5 μL，dNTP Mix 4 μL，引物HCO2198 2 μL，引物LCO1490 2 μL，无菌水26.5 μL，模板5 μL。PCR程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，45 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，6个循环，94 ℃变性1 min，51 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃总延伸10 min。利用凝胶成像系统观察结果，并使用Omega质粒提取试剂盒切胶回收，送至上海生物工程技术有限公司进行测序，利用GeneStudio修正测序得到的中华三脊甲部分COI序列(GenBank序列号MF133458)，上传至NCBI网站上进行Blast，与GenBank中已有序列进行同源性比对，选择其中合适的序列结果用Mega7.0软件建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态特征

幼虫 体扁平，黄色半透明，老熟幼虫体长5.5～6.0 mm。头部部分外露，约3/4隐藏于前胸内，头壳凹顶形，头叶部分明显短于头长之半，口器向前。胸部无足，与腹部颜色相同，或稍淡；前胸呈半圆形，前缘向前延伸呈弧形，后缘向后弯曲呈弓形；中胸略宽于前胸后缘，中部略窄于两侧，前侧缘两边各具一小刺突，刺突后具一微突；后胸宽略小于中胸，近长方形，侧缘中部各具一突起，大小和中胸相当。腹部9节，各节连接处明显呈沟状，第1～3腹节宽度大致相同，4～6腹节宽略小于第3腹节，第7腹节后逐渐减小，腹节最宽处不超过中后胸；除第9腹节外，每腹节两侧各具1对突起，突起部分外侧各具1管状刺突，第1～5对突起近半圆形，第6～8对接近三角形，除第1对刺突平指两侧外，其余刺突均略斜指向后方，且角度逐渐增大。第9腹节分节明显，两侧无突起和刺突，肛门位于第9腹节腹面，顶端中央略凹陷。幼虫具有9对气孔，胸部1对，位于中胸前侧角，锥形长管状，大而明显；其余8对分别位于腹部1～8腹节侧缘基部，不明显(图1A)。

蛹 长条形，长6.5～7.5 mm。头部光秃，中央凹陷。前胸梯形，两侧弧圆，中央高于头部，盘区宽阔，长略胜于宽；中胸略宽于前胸，中部两侧各具1个圆形凹窝，后缘与后胸结合处呈弓形；后胸长显胜于中胸，后缘中部稍向腹部延伸。腹部9节，两侧无突起，每节中部颜色较深，第2～7腹节背板中央有一些小突起，第7腹节中部及第8腹节后缘具少量淡色毛；除第9腹节外，其余每腹节侧缘各具气孔1对，第1对气孔较短，不清晰，第2～6对气孔大而明显，短管状，显著突出于侧缘，6对气孔均位于侧缘中部偏后，第7～8对气孔细而小，不甚清晰，位于侧缘端部。从腹面看，头部口器各部分较为清晰，触角紧贴身体两侧，末端伸至前足腿节末端，3对足及2对翅特征明显，清晰可辨，各腹节后缘光亮，稍微隆起，第8腹节中部内凹，几乎被第9腹节前缘分为两半(图1B)。

成虫 体长方形，约6.2 mm，较扁阔，棕红色，具光泽，触角褐黑，基部两节略红，鞘翅黑色，腹面及足棕黄色。头部与前胸前缘等阔，头顶光滑无刻点。前胸阔略胜于长，两侧边框显著，盘区刻点粗疏，前缘一横列刻点，中部间断，基部中央两侧各有一浅斜凹。鞘翅基较前胸略阔，肩后边缘较膨，端缘锯齿明显，每翅脊线3条，第1，2条完整，第3条大部中断，仅留基、端两处，刻点8行，除第3脊线与侧缘中部刻点并成1行，其余均为双行，足粗短，前足跗节较宽大，中后足跗节较小，短于胫节[1](图1C)。

2.2 生物学 经野外观察和实验室饲养发现，中华三脊甲1 a发生1代，以成虫越冬，贵州荔波于3月下旬出现，赣南地区于4月初出现。成虫产卵半嵌于叶内(图1D)，孵化后的幼虫可自产卵孔钻入叶内于叶片上下表皮之间取食叶肉，随着不断取食，形成潜道，潜食后潜道表面塌陷，似凹凸不平，叶肉部分被取食殆尽，形成白色大斑状潜道(图1E)，被取食部分基本无法进行光合作用，严重影响整体叶片的光合作用，且导致叶片易脱落，影响植物的整体光合作用及长势。幼虫老熟后在潜道内完成化蛹，有预蛹期，8月中、下旬蛹期结束后在潜道内羽化，待体色沉着和身体硬化后才钻出潜道。成虫羽化钻出后留下完整潜道，边缘无破损，只有产卵孔及成虫钻出潜道的孔。成虫具飞翔能力，活动能力强，受惊后会立即飞走或掉落假死。

寄主：禾本科Gramineae簝竹属[1]；刚竹属、大节竹属大节竹、簕竹属坭竹(新寄主记录)。

分布：山东、福建、广东、广西、贵州、云南[1]；江西(龙南县安基山森林公园、龙南县九连山国家自然保护区—新记录地)。

注：A.幼虫背腹面；B.蛹背腹面；C.成虫背腹面；D.卵；E.潜道；F-G.雌雄差异(F.中足；G.触角)(图中标尺均为1 mm)图1 中华三脊甲各虫态及雌雄差异比较

2.3 中华三脊甲进化关系 中华三脊甲COI基因片段长约688 bp，碱基A,T,G,C含量分别为33.6%,38.2%,14.5%,13.7%；A+T含量远大于C+G含量，具有明显的偏向性，符合昆虫COI基因特点。上传中华三脊甲COI序列至GenBank，取得基因号MF133458。基于Blast结果，以星天牛Anoplophorachinensis和桑天牛Apriponagermari作为外群(outgroup)，利用Mega7.0构建系统发育NJ树(图2)。基于发育树分析，龟甲属Cassida和梳龟甲属Aspidimorpha为1支、沟龟甲属Chiridopsis和蜡龟甲属Laccoptera为1支，掌铁甲属Platypria、铁甲属Hispa和稻铁甲属Dicladispa等铁甲类为1支，中华三脊甲、Anisostena属和Sumitrosis属为1支，Microrhopala属、Baliosus属和Charidotella属为1支。

图2 中华三脊甲与其它龟甲亚科昆虫的亲缘关系

3 结论与讨论

中华三脊甲为江西省新记录种，在国内山东、福建、广东、广西、贵州、云南等地区分布[1]。值得注意的是，中华三脊甲呈现地区性变异[1]，江西赣南标本前胸背板刻点较稀，中央小区域无刻点，刻点大而粗；贵州荔波标本前胸背板刻点较密，布及整个背板，刻点小。中华三脊甲成虫在感受到危险时，常会假死并掉落下来，这与枣掌铁甲类似[9]，是昆虫的一种自我保护方式。而枣掌铁甲Platypriamelli及其它部分潜叶虫的转移潜道行为[9,10]，在中华三脊甲中并未发现，这应该是由于中华三脊甲幼虫不具胸足所致，在脱离原潜道后无法固定身体及寻找合适的地点，无法快速转移也使得幼虫不能适应外界多变的环境以及天敌的存在。中华三脊甲成虫常产卵在嫩叶上，幼虫就地取食嫩叶，这与取食桉树的叶甲Chrysophthartaagricola[11]类似，易造成叶片脱落和枯死，造成经济损失。

中华三脊甲雌雄有较为明显的差异，主要表现为：雄虫中足胫节较雌虫细而弯，略呈镰刀状，而雌虫中足胫节明显宽阔且略弯[1]；雄虫触角显较雌虫为长，雄虫触角可达体长1/3，雌虫触角只有体长的1/4左右(图1F、G)。

从系统发育树来看，龟甲属、梳龟甲属、沟龟甲属、蜡龟甲属为一大支，均属于龟甲类，掌铁甲属、铁甲属、稻铁甲属为一大支，均属于铁甲类，这两支同源性高，与陈世骧[4]的铁甲志分类相类似。中华三脊甲与Anisostena属接近，与Sumitrosis属较为接近，三者属脊甲类，成虫形态上相似，初步证明分子手段可以辅助形态学分类。Anisostena属和Sumitrosis属尚无中国分布记录，这三属间的亲缘关系有待进一步研究。未来可以通过潜叶铁甲的食性分析，探讨取食竹类潜叶害虫的起源与演化途径。

志谢：感谢黔南民族师范学院俞筱押副教授和赣南师范大学符潮帮助鉴定植物标本，感谢潜叶昆虫组的各位同学帮忙采集制作标本、扫描图片及整理名录等工作，感谢江西省安基山森林公园、九连山国家级自然保护区、贵州省茂兰国家级自然保护区和中科院西双版纳植物园提供采集便利。