miR-182通过HES1调控宫颈癌耐放疗细胞株的上皮间质转化

李睿歆 谢庆生 王丽娟 李晶 饶群仙 林仲秋

作者单位：510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院妇科肿瘤专科

放疗适用于各期宫颈癌的治疗，但放疗耐受是导致复发和远处转移的重要因素，严重影响患者预后。在肿瘤发展过程中，上皮细胞表现出间质表型，发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），使肿瘤细胞离开原发灶形成转移［1］。文献报道EMT在多种恶性肿瘤的放疗耐受中发挥作用［2-4］。miRNA是一类广泛参与肿瘤发生、发展各个环节的非编码RNA［5-6］。其中miR-182在肿瘤的EMT、转移及放疗耐受中均发挥作用［7-10］。其在宫颈癌原发灶中的表达与肿瘤分期呈正相关［11］，发挥类似癌基因作用。发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，HES1）是Notch通路下游分子，受miRNA、泛素化等多种方式调控［12-14］，同时参与EMT及放疗敏感性调控［15-17］。本课题组前期研究建立体外宫颈癌耐放疗模型［4］，发现HES1可抑制宫颈癌HeLa和SiHa细胞迁移和侵袭，且可逆转EMT［18］。在甲状腺癌中，miR-182通过抑制HES1表达发挥促转移作用［19］，但其在宫颈癌中是否存在类似机制尚不清楚。本研究探讨miR-182在宫颈癌耐放疗细胞株中的作用及其与HES1的调控关系，为宫颈癌耐放疗治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

人宫颈癌细胞株HeLa、SiHa购自中科院上海细胞库，MEM培养基、胎牛血清购自以色列BI公司，opti-MEM购自美国Hyclone公司，LiPofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司，Trizol逆转录试剂盒、SYBERⅡ、聚合酶链反应（PCR）引物购自日本TAKALA公司，HES1、miR-182小干扰RNA购自上海吉玛制药技术有限公司，HES1抗体购自英国Abcam公司，β-actin抗体、EMT抗体购自美国CST公司，Transwell小室（滤膜孔径8 μm）购自美国Corning公司，基质胶购自美国BD公司。SIMENS PRIMUS H型直线加速器购自德国SIMENS公司，BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR仪器购自美国Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 宫颈癌耐放疗HeLa、SiHa细胞的构建 HeLa、SiHa细胞置于含10%胎牛血清的MEM培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。按本课题组前期方法［6］，通过分割剂量照射法诱导宫颈癌耐放疗HeLa、SiHa细胞，总照射剂量为24 Gy。其中HeLa、SiHa细胞分别每周4 Gy照射1次（HR4和SR4组），共照射6周；每周6 Gy照射1次（HR6和SR6组），共照射4周。各组细胞完成全部照射次数后继续传代培养。

1.2.2 细胞转染 经筛选选取耐放疗HR6细胞进行转染，HES1 siRNA、miR-182 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，按siRNA和Lipofectamine 2000说明书，将待转序列HES1 siRNA、miR-182 siRNA或阴性对照序列混合，室温反应5 min后加入6孔板中，48 h后收集细胞提取RNA，RT-qPCR检测miR-182和HES1的表达。以MEM培养基培养的HR6细胞为空白对照组。转染序列：miR-182 siRNA为5'-AGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3'，miR-182 siRNA阴性对照为 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'；HES1 siRNA为5'-CCAACUGCAUGACCCAGAUTT-3',HES1 siRNA阴性对照为5'-AUCUGGGUCAUGCAGUUGGTT-3'。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3 RT-qPCR检测miR-182和HES1 mRNA的表达常规提取细胞RNA，参照Takara逆转录试剂盒说明书逆转录，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。逆转录为cDNA后，通过Real-Time PCR仪器进行扩增。PCR反应条件：95℃变性5 s，60℃延伸30 s，循环40次。PCR引物序列见表1。U6为miRNA检测内参，GAPDH为mRNA检测内参。RT-qPCR结果分析采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。实验独立重复3次。

1.2.4 Western blot实验检测HeLa、SiHa细胞HES1蛋白的表达 常规提取细胞总蛋白并定量，10%SDS-聚乙酰凝胶电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，加一抗后4℃摇床孵育过夜，山羊抗兔、抗鼠二抗室温孵育2 h，ECL法显影，曝光。β-actin为内参。

1.2.5 Transwell小室法检测HR6细胞的迁移能力分别将HR6组、HR6 SI组（转入miR-182 siRNA）和HR6 NC组（转入siRNA 阴性对照）按8.5×104个/孔加入6孔板中。细胞瞬时转染16 h后，重悬转入24孔板中。200 μL细胞悬液加入上室，600 μL含10%胎牛血清的MEM培养基加入下室。置于培养箱中培养24 h，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min，棉签擦去未穿过膜的细胞。显微镜下（×400）计数穿过膜的细胞数。每组实验设3个复孔。

1.2.6 Transwell小室法检测HR6细胞的侵袭能力常规制备上室基质胶后，每孔上室加入含8.5×104个HR6细胞的200μL细胞悬液，下室加入600 μL含20%胎牛血清的MEM培养基，细胞培养48 h后4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min。上室未穿膜细胞被擦除后计数。每组实验设3个复孔。

1.3 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示。HES1、miR-182、E-cadherin 等表达数据组间比较采用Kruskal-Wallis检验，Slug数据组间比较采用单因素方差分析，若整体差异有统计学意义，进一步的多重比较采用Bonferroni检验；迁移、侵袭实验中的两组数据比较采用独立样本t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗可抑制HES1表达，诱导miR-182表达升高

与未照射宫颈癌HeLa、SiHa细胞比较，耐放疗细胞 HR4、HR6、SR4、SR6中，HES1 mRNA 及蛋白表达均显著受抑制，且随单次放疗剂量增加，HES1受抑制程度逐渐加深（P＜0.05），见图1A～D。与未照射宫颈癌SiHa细胞比较，耐放疗SR4细胞中miR-182 mRNA的表达出现明显折点，其表达水平显著高于SR6细胞（P＜0.05）。耐放疗HR4细胞中miR-182 mRNA的表达水平与未照射宫颈癌HeLa细胞差异无统计学意义（P＞0.05），但在 HR6细胞中表达明显升高（P＜0.05），见图1E～F。故本研究选取HR6细胞进行后续实验。

图1 分割放疗对不同宫颈癌HeLa、SiHa细胞HES1及miR-182表达的影响

2.2 下调miR-182表达可抑制细胞迁移、侵袭及EMT

迁移和侵袭实验显示，HR6 SI组的穿膜细胞数均明显少于HR6 NC组（P＜0.05）。EMT相关因子检测结果显示，HR6 SI组E-cadherin的mRNA及蛋白表达显著增加，而SlugmRNA及蛋白表达则降低。其中HR6NC组E-cadherin和Slug mRNA及蛋白表达与HR6组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而HR6 SI组分别与HR6 NC组和HR6组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 HR6细胞中miR-182与HES1相互表达的影响

RT-qPCR和Western blot实验结果显示，分别与HR6 NC组和HR6组比较，HR6 SI组细胞中HES1 mRNA及蛋白的表达均显著升高 (P＜0.05)，见图3A～B。RT-qPCR实验结果显示，HR6组、HR6 NC组和HR6 SI组细胞中miR-182 mRNA的表达无明显变化，见图3C。

3 讨论

放疗是宫颈癌重要的治疗手段之一，而放疗耐受是治疗失败的主要原因。有研究显示肺癌、结肠癌放疗后HES1表达受抑制［17-20］。在人胰腺癌细胞株（PANC-1、SW1990、MIA、PaCa-2）中，随放射剂量增加，HES1 表达水平亦逐渐降低［21］。本研究采用本课题组前期在体外构建宫颈癌耐放疗模型方法［4］，通过单剂量分割放疗建立宫颈癌耐放疗细胞 HR4、HR6、SR4、SR6，结果发现，与未照射宫颈癌HeLa、SiHa细胞比较，4株耐放疗细胞中HES1的表达均降低，而miR-182表达均升高，推测miR-182和HES1可能参与宫颈癌的放疗耐受。

图2 下调miR-182对HR6细胞转移能力及EMT相关因子的影响

图3 HR6细胞中miR-182与HES1相互表达的影响

本研究还发现，与未照射的宫颈癌HeLa细胞比较，HR6细胞中miR-182表达显著升高，但在HR4细胞中其表达差异不大。而在SiHa细胞中，放疗亦诱导了miR-182表达，但其表达水平峰值出现在单次放疗剂量为4 Gy的细胞中，即SR4细胞，目前原因不明。有研究观察毛细血管共济失调患者和健康捐赠者T淋巴细胞中miR-182的表达，单剂量2 Gy照射后，miR-182表达峰值出现在24 h时，且2名健康捐赠者峰值有所不同［22］。综合本研究结果及文献，认为miR-182对放疗的反应可能不仅有剂量依赖性，亦可能存在时间依赖性和个体差异性，这亦可能是不同单次照射剂量及不同细胞株中miR-182表达存在差异的原因。综上，鉴于本课题组前期研究发现HR6的放疗耐受性最强，并结合本研究结果，故选择HR6进行后续实验。

目前研究认为EMT与多种恶性肿瘤放疗耐受相关。在胰腺癌耐放疗细胞株中，E-cadherin表达降低，Vimentin表达升高，且细胞形态发生改变［2］。食管癌中，放疗诱导的E-cadherin下调和N-cadherin上调被认为是导致耐放疗的原因［3］。研究发现沉默miR-182可诱导上皮标志物CDH1，抑制间质标志物CDH2，从而逆转TGF-β诱导的EMT和转移［7］。Zhang等［23］研究显示，miR-182可诱导Vimentin和FN1表达，抑制E-cadherin，从而促进乳腺癌MCF-7和T47D细胞的EMT和侵袭。但目前，在宫颈癌耐放疗细胞中下调miR-182是否亦发挥抑制EMT作用尚未知。本研究采用RNAi技术下调HR6细胞中miR-182的表达，结果发现，下调后上皮细胞标志物E-cadherin表达增强，而间质细胞标志物Slug表达减弱，提示在HR6细胞中下调miR-182可能抑制EMT。

有文献报道在甲状腺髓样癌中，miR-182可靶向HES1 3'-UTR，从而抑制HES1表达并促进肿瘤转移［19］。本课题组前期研究亦显示HES1在宫颈癌HeLa细胞中通过逆转EMT而发挥抑制迁移和侵袭的作用［18］。为观察耐放疗宫颈癌细胞中是否亦发挥上述作用，本研究下调miR-182后，采用Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力，发现HR6穿膜细胞数均明显减少，与Yang等［24］在结肠癌中的研究结果一致。进一步在HR6细胞中下调miR-182，发现HES1表达明显升高，而下调HES1并不影响miR-182表达，提示在宫颈癌耐放疗细胞HR6中，抑制miR-182可上调HES1表达并逆转EMT，同时抑制细胞迁移和侵袭，而miR-182可能通过靶向HES1发挥作用，但miR-182靶点的具体连接部位及相关机制有待进一步研究。