原油水溶性组分对2种微藻的毒性效应及微藻对石油烃的降解研究初探

刘星辰，鞠 青

（1.青岛一中，山东青岛 266071；2.青岛市环境监测中心站，山东青岛 266071）

近年，石油作为重要能源之一，被世界各国广泛使用。随着海洋石油勘探业及石油海运业飞速发展，石油开采、储存、运输过程中产生的泄漏及运输船舶的突发事故导致石油污染事故频发，严重影响海洋生态系统的安全与健康[1-3]。在我国，石油烃污染已逐渐成为海洋污染的主要问题之一。原油化学成分复杂，迁移转化过程也有较多变化，主要包括烃类化合物（饱和烃类、芳香烃类等）和非烃类组分（含硫化合物、含氮化合物）等[4-5]。其水溶性成分（water-accommodated fraction，WAF）是引起海洋生物毒性效应的主要组分，其中毒性最大的是微量溶于水的芳香烃类化合物，如萘、蒽、芘、苯并芘。在污染产生的较短时间内，中小分子量的多环芳烃，如萘、菲、芘、荧蒽是对海洋生物危害最大的4种成分[6]。

海洋微藻是海洋生物资源的重要组成部分，也是海洋生态系统中的主要初级生产者。海洋微藻具有分布广、数量多、繁殖快的特点，是多种污染物影响海洋生态系统的重要起点[7]。WAF能对海洋微藻产生毒性效应，从而破坏海洋食物链，进而长时间影响海洋生物多样性[8]。而且，由于海洋微藻处于食物链底端，若受到WAF的影响，毒性会随食物链传递，影响到层级较高的生物，从而影响整个海洋生态系统[9]。

文中以近岸常见种三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和小球藻Chlorella vulgaris，探索WAF对其生长的毒性效应以及两种微藻对WAF的降解能力，以揭示石油烃对海洋生态系统的影响，为海上溢油的环境影响研究提供基础理论数据。

1 材料与方法

1.1 微藻及其培养

实验所用藻种为中国海洋大学微藻种质库的三角褐指藻和小球藻。2种微藻使用f/2培养基[10]进行培养。

将生长至指数生长期的微藻用于实验。实验海水为青岛近海自然海水，纱布过滤后用0.45 μm的微孔滤膜抽滤并灭菌。接种微藻于250 mL锥形瓶中，置于光照培养箱中培养，温度为24±2℃，光照强度为3 000 lx，明暗周期为12 h：12 h。实验期间保持所有实验瓶受光均匀，并每天定时摇瓶3次。2种微藻相同处理。

1.2 原油水溶性组分（WAF）母液制备

原油取自胜利油田，放于阴凉处避光保存。

将已抽滤并灭菌的海水与原油按照1：9的体积比混合，在避光的条件下，将原油混合液置于磁力搅拌器上连续搅拌24 h，后将混合液倒入分液漏斗中静置3 h以上，将分液漏斗中的水相放出，置于棕色试剂瓶中于冰箱（4～6℃）内保存。用紫外分光光度计在225 nm波长下测定WAF母液中石油烃的浓度，并根据实验需要对母液进行梯度稀释。

1.3 WAF的毒性实验

根据预实验结果，三角褐指藻和小球藻分9个等比浓度梯度进行培养。2种藻的培养液中含有的石油烃的浓度见表1，每组设3个平行，一次性培养96 h，在第0、24、48、72和96 h取样，在光学显微镜下用血球计数板统计藻细胞的数目并计算细胞密度。

2种藻的相对生长率、抑制率及半最大效应浓度（half maximal effective concentration,EC50）按照国际经合组织（OECD）[11]和国家标准规定[12]的化学品藻类生长抑制标准方法计算。

表1WAF浓度设置Tab.1 Different concentration of WAF

藻类相对生长率的计算：

μt：时间为t时，藻的相对生长率；N1：t1时藻类细胞密度（起始密度）；Nn：tn时的藻类细胞密度。

藻类抑制率的计算：

I：时间为t时，藻的抑制率；μC：对照组相对生长速率；μt：时间为t时，藻的相对生长率。将抑制率导入PROBIT线性回归方程得出96 h EC50，并检验。

1.4 微藻对石油烃的降解

石油烃对微藻的毒性胁迫实验完成后，测定培养液中石油烃的剩余量。降解率的计算[13]：

η：WAF降解率，%；C0：空白对照的石油烃质量浓度，mg/L；C1：溶液中的石油烃质量浓度，mg/L。

(3)1型糖尿病患者活动时,应把握好胰岛素剂量、饮食与活动三者之间的相互关系,因其在接受胰岛素治疗时,常波动于相对不足和过多之间。前者可因活动时肝糖输出明显增多而葡萄糖利用不增加导致血糖升高、游离脂肪酸和酮体生成增加;后者易造成低血糖。一般可在活动前少量补充额外食物或减少胰岛素用量,活动量不宜大,时间不宜过长,以15~30min为宜,活动时随身携带甜点及写有姓名、家庭住址和病情的卡片以应急需。

1.5 数据处理

各指标的差异显著性采用SPSS软件进行单因素方差分析，显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 原油水溶性组分WAF对2种微藻种群增长的影响

不同浓度的WAF对三角褐指藻细胞密度的影响如图1所示。从图1可以看出，对照组的三角褐指藻生长良好，呈指数增长。在48～72 h之间，低剂量处理组（第8、9组）中，受到WAF的刺激，三角褐指藻细胞密度高于对照组（P＜0.05）。随着胁迫时间延长，WAF的剂量增大，高WAF浓度组（第1、2组）的细胞密度显著低于对照组（P＜0.05）。经WAF处理后，小球藻细胞密度变化如图2所示，低浓度的WAF（处理组8）对小球藻的生长同样具有促进作用，96 h的藻细胞密度显著高于对照组（P＜0.05）。96 h时，高浓度 WAF组（第1、2、3、4组）的藻密度随WAF浓度的增大而显著降低（P＜0.05）与对照组差异显著，呈现明显的剂量-时间效应。

图1 WAF对三角褐指藻细胞密度的影响Fig.1 Eeffects of WAF on the cell density of P.tricornutum

分析三角褐指藻和小球藻的相对生长率可知（表2），低浓度WAF组中，三角褐指藻的相对生长率仅仅略有降低，与对照组相比降低5%。经高浓度WAF（第1组）胁迫的三角褐指藻的相对生长率显著低于对照组21%（P＜0.05）。WAF浓度为0.36 mg/L时，小球藻的相对生长率略高于对照组但差异不显著（P=0.301），而相同处理组中，三角褐指藻的相对生长率低于其对照组，且差异显著（P＜0.05）。之后随着WAF浓度增加且处理时间延长，小球藻的相对生长率逐渐降低。相对于对照组，高浓度处理组（第1组）中小球藻的相对生长率降低75%。与三角褐指藻相比，小球藻相对生长率的降幅较大。

2.2 原油水溶性组分WAF对2种微藻种群的抑制

不同浓度的WAF对三角褐指藻和小球藻96 h的抑制率见表3。结果表明，低浓度WAF（9、8、7、6 和 5 组）对三角褐指藻和小球藻的抑制率较低。处理组8中，WAF对小球藻的抑制率为-3.00%。表明该浓度下，WAF对小球藻生长具有明显的刺激作用。随着WAF的浓度增加（1、2、3和 4组），其对三角褐指藻和小球藻的生长抑制率逐渐提高，而且对小球藻的抑制率显著高于同组的三角褐指藻。随着WAF浓度升高，其对小球藻生长的抑制显著增大（38.2%～74.0%），而对三角褐指藻的胁迫较小，抑制率为5.95%～21.0%。

图2 WAF对小球藻细胞密度的影响Fig.2 Eeffects of WAF on the cell density of C.vulgaris

表2 原油WAF对2种海洋微藻相对生长率Tab.2 The relative growth rate of P.tricorntum and C.vulgaris

WAF最高浓度处理组（27.88 mg/L）中，三角褐指藻96 h时的抑制率仅为21.0%，计算WAF对其的EC50为49.1 mg/L。根据不同浓度WAF对小球藻的抑制率计算EC50。WAF对小球藻的96 h EC50为13.2 mg/L。因此三角褐指藻的96 h EC50显著高于小球藻。

表3 原油WAF对2种海洋微藻抑制率Tab.3 The Inhibition rate of WAF on P.tricorntum and C.vulgaris

2.3 2种海洋微藻对WAF的降解效果

表4 2种海洋微藻在不同浓度WAF培养后WAF的剩余量及降幅Tab.4 The beginning and end WAF concentrations of two microalgae cultured

3 讨论

研究结果表明，低剂量处理组（第8组）WAF对三角褐指藻和小球藻的生长有轻微的促进作用，其可能的原因是低剂量的毒物对微藻生长有刺激作用。黄逸君等[14]研究发现在低浓度的WAF刺激下，浮游植物会爆发性增长。其他研究人员通过实验室及野外围隔实验也表明，海水中低浓度的WAF能够促进浮游植物的生长[15-18]。邓结平等[19]的研究表明，在低浓度四溴双酚A（TBBPA）（1.0 mg/L）的作用下，牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri的相对生长率略高于对照组。低浓度的毒物对微藻生长有刺激效应，其原因可能是藻细胞内自由基含量升高，从而促进其生理生化代谢及繁殖，以达到稀释毒性胁迫的目的[20]。还有研究推测低浓度WAF能促进藻类生长是由于水体中的微生物能够降解石油烃中的部分化合物，将其转化为藻类可以利用的碳源，从而表现出低浓度的WAF能够促进藻类生长的现象[17-18]。因此有研究认为，由低浓度WAF引起的浮游植物大量繁殖可能是赤潮的诱因之一[14]。

96 h时，高WAF浓度组的三角褐指藻和小球藻藻密度随WAF浓度的增大而显著降低并呈现明显的剂量时间效应。许多研究发现，高浓度的WAF通过影响浮游植物的生理过程和生化组成，降低其细胞密度。例如，高浓度的WAF能够改变浮游植物体内的叶绿素a的含量对浮游植物造成严重影响[21-23]，还能抑制浮游植物吸收碳源和营养盐，抑制细胞分裂、光合作用以及呼吸作用[24]。石油烃中的某些组分还能够破坏藻类细胞中质膜、线粒体膜以及叶绿体膜等结构，从而抑制微藻的正常生长及代谢[25]。本研究中，三角褐指藻和小球藻在高浓度WAF组中细胞密度的下降，可能正是由于上述生理过程受到影响所致。

分析WAF对2种微藻种群增长的影响，低浓度WAF处理条件下，小球藻的藻密度和增长率较高；随着WAF的浓度增大，处理时间延长，小球藻的藻密度和增长率大幅降低，降低幅度显著高于三角褐指藻，可见WAF对小球藻的抑制率显著高于三角褐指藻。而且三角褐指藻的EC50远远高于小球藻，表明两种微藻对WAF的耐受性不同。与本研究类似，大量研究发现，不同藻类对同种污染物的耐受能力存在明显的种间差异。例如，三角褐指藻和淡水绿藻Pseudokirchneriella subcapitata对表面活性剂的耐受性较强，而中肋骨条藻Skeletonema costatum和淡水微藻栅藻Scenedesmus quadricauda对表面活性剂较为敏感，可能是与藻细胞内解毒代谢相关酶的活性有关[26]。邓结平等[19]研究了四溴双酚A（TBBPA）对7种不同微藻生长的影响，结果表明微拟球藻Nannochloropsis salina和牟氏角毛藻对TBBPA最为敏感，可以作为指示生物。

实验结束时，2种微藻培养液中WAF的浓度均有显著降低，表明三角褐指藻和小球藻对不同浓度的WAF均有一定程度的降解作用。低浓度WAF胁迫下，小球藻对其的降解率为76.1%，大于三角褐指藻。随着WAF浓度增高，三角褐指藻的降解能力增强。高浓度处理组（第4组）中，三角褐指藻对WAF的降解率为78.9%。张玉荣等发现微绿球藻Nannochloris oculata、中肋骨条藻和塔玛亚历山大藻Alexandrium tamarense对浓度低于2 mg/L的石油烃具有较好的降解效果[27]。多项研究表明小球藻属Chlorella、舟形藻属Navicula和菱形藻属Nitzschi的藻类也可以对WAF进行降解和转化[28-29]。当石油浓度为3.5 mg/L时，小球藻和杜氏盐藻对带共轭双键的烃类化合物和芳烃的降解效率均最大，而且小球藻的降解能力略好于盐藻[30]。因此可以推断，不同藻类对WAF的降解率也有不同，结合WAF对2种微藻种群增长的影响，低浓度WAF对小球藻的生长有促进作用，小球藻生长较好，藻密度较高，对WAF的降解率高。而三角褐指藻对高浓度WAF的耐受性好，细胞密度较高，因此其对WAF的降解率也较高。之后随着WAF浓度的继续升高，三角褐指藻生长受到抑制，降解率逐渐降低。

4 结论

（1）处理组8中，小球藻的相对生长率为0.73，高于对照组，且WAF对其的抑制率为-3.00，因此推断低浓度的WAF能够刺激小球藻的生长。随WAF浓度增加，三角褐指藻和小球藻的生长受到抑制。抑制程度呈现明显的时间和剂量效应。

（2）小球藻对低浓度的WAF适应性较好，生长迅速。而三角褐指藻对高浓度的WAF耐受性较好，最高浓度处理组的抑制率仅为21.0%，而小球藻的抑制率为74.0%。表明不同藻类对WAF的耐受性不同，耐受浓度范围也不同。

（3）三角褐指藻和小球藻对WAF都有降解作用，而且三角褐指藻对3.49 mg/L WAF的降解率为78.9%，降解率较高，可以用于降解含有较高浓度WAF的污染海水。