超声处理对虾青素稳定性和抗氧化性的影响

张丽瑶，张华敏，王志祥，崔志芹

（中国药科大学，江苏 南京 210009）

虾青素（3, 3’-二羟基-4, 4’-二酮基-β, β’-胡萝卜素）属类胡萝卜素，其分子具有高度对称结构，有4种几何异构体[1-2]，即全反式、9-顺式、13-顺式和15-顺式异构体，见图1。室温条件下，虾青素在丙酮、二氯甲烷、二甲亚砜、乙醇及其他非极性溶剂中的溶解性较好[3]。虾青素有很强的抗氧化性[4-5]，具有抗肿瘤、保护心血管及增强免疫力等多方面生理功能[6-7]。

虾青素分子结构中含很多长共轭不饱和双键，因此性质极不稳定，对光、热、氧都比较敏感[8-11]。王红霞等[12]从温度、光照、氧气、保存条件等方面考察了虾青素的稳定性，采用分光光度法进行含量测定，结果显示光照、温度、氧气均会影响虾青素的稳定性，其中氧气的影响最为明显。

超声提取技术是近年应用于有效成分提取分离的一种常用手段。超声波产生的空化效应、热效应及搅拌作用等，都可加速有效成分进入溶剂，从而提高提取效率，缩短提取时间，节约溶剂。本文研究了超声波对虾青素稳定性的影响，并在此基础上进行了虾青素1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除实验，考察了虾青素抗氧化性的变化，为虾青素的超声提取提供依据。

图1 虾青素4种几何异构体

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-10A TVP高效液相色谱仪（日本岛津公司）；HH-4日本数显恒温水浴锅（国华电器）。

1.2 材料

虾青素对照品（纯度98 %，南京泽朗）；5 %虾青素（南京泽朗）；DPPH（纯度＞97 %，Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色谱纯，江苏汉邦）；二氯甲烷（AR，江苏强盛功能）。

2 方法

2.1 色谱条件

Diamond C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相:甲醇:二氯甲烷:乙腈:水=85:5:5:5；流速为0.8 ml/min；检测波长470 nm。

2.2 虾青素稳定性考察

精密称取5 %的虾青素300 mg于50 ml棕色量瓶中，加适量二氯甲烷，室温超声约30 s使之溶解，加二氯甲烷稀释至刻度；0.45 μm滤膜过滤，精密移取8.0 ml滤液至棕色量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，作为处理前虾青素样品溶液待用。

精确移取10 ml虾青素样品溶液于大口样品管中，将超声发生器的探针插入虾青素液面以下，超声功率分别设为200，300，500 W，每组样品超声时间分别为0.5，1，2 h，各组的超声条件均为超声0.3 s，间隔0.3 s。冷却定容至刻度，HPLC分析，考察不同超声功率和超声时间对虾青素稳定性的影响。每个实验重复测定3组。

2.3 DPPH自由基清除实验

精密称取DPPH 25 mg于50 ml棕色量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，作为DPPH反应液。精确称取5 %虾青素0.63 g于100 ml棕色量瓶中，加甲醇约80 ml，室温水浴超声溶解30 s，加甲醇稀释至刻度，摇匀；0.45μm滤膜过滤，作为1#样品溶液。取1#样品溶液25 ml，超声处理2 h后，定容至刻度，得2#溶液。将虾青素1#、2#样品溶液分别与上述DPPH反应液按1:1混合，37 ℃水浴恒温避光反应30 min，采用HPLC分析反应前后DPPH的峰面积变化，计算出相应DPPH浓度，按下式计算DPPH自由基的清除率。

式中：C0为反应前DPPH浓度（mg/ml）；Ci为反应后DPPH浓度（mg/ml）。

3 结果与分析

3.1 HPLC色谱图

虾青素对照品为全反式结构，保留时间约12 min，色谱图见图2。5 %虾青素中除了全反式虾青素外，还含9-顺、13-顺和15-顺3种异构体，保留时间分别约17.5，19，21.5 min。

图2 虾青素对照品色谱图

3.2 超声对虾青素稳定性的影响

虾青素溶液经500 W探针式超声处理后HPLC谱图见图3，虾青素样品溶液经超声后，溶液中虾青素各异构体的浓度见表1。按下式计算异构体转化率。

式中ΔC为光照后全反式异构体减少的浓度（μg/ml）；ΔC9为光照后9-顺式异构体增加的浓度（μg/ml）；ΔC13为光照后13-顺式异构体增加的浓度（μg/ml）；ΔC15为光照后15-顺式异构体增加的浓度（μg/ml）。

由图3和表1可见，虾青素溶液经超声处理后，全反式异构体的浓度大幅度降低，9-顺式和13-顺式异构体浓度均有所增加，其中13-顺式异构体含量升高较多，15-顺式异构体含量很低，几乎未检测到。我们认为超声处理使虾青素降解为其他成分，同时也引起了异构体之间的相互转化。

图3 500W探针超声处理2 h HPLC色谱图

表1 探针式超声前后虾青素异构体的浓度

由表1可见，随超声时间的延长，全反式虾青素的降解也愈显著；且随着超声功率的增大，全反式虾青素的浓度也逐渐下降。超声促使全反式虾青素的降解这一结论在文献中也有提及。赵立艳等[13]研究发现，超声使全反式虾青素降解为未知的无色物质，并且这种降解作用随着超声时间的延长和超声功率的提高而加剧。

3.3 DPPH清除实验

3.3.1 DPPH检测方法 在评价抗氧化剂的DPPH清除率时，分光光度法是一种常用方法，但并不适用于有色样品的测定，因为样品的颜色会对测定结果造成干扰。本文采用HPLC 测定溶液中DPPH浓度。为分析方便，DPPH分析条件与虾青素一致，检测波长为517 nm。DPPH的保留时间约5.2 min。所得DPPH对照品色谱图见图4。

图4 DPPH对照品色谱图

3.3.2 DPPH清除实验 分别测定虾青素1#，2#样品溶液对DPPH自由基的清除率，并分析了各样品反应前后溶液中9-顺式和13-顺式异构体的含量，结果见表2。实验发现，虾青素经探针式超声处理后，虽然全反式的浓度有所降低，清除率却达100 %，且反应后样品溶液中几乎检测不到9-顺式和13-顺式异构体，说明这两种异构体虽然浓度很低，但都参与了DPPH自由基的清除反应。

表2 DPPH清除实验结果

4 结论

作为一种具有高抗氧化活性的类胡萝卜素，虾青素极不稳定，易发生降解和异构体之间的转化。虾青素溶液经探针式超声后，全反式异构体的浓度大幅降低，而9-顺式和13-顺式异构体浓度均有所增加，超声不仅使虾青素降解为其他成分，同时也引起了异构体之间的相互转化。在DPPH自由基清除实验中，经超声处理后的虾青素清除能力大大增强，达100 %。