硫酸软骨素中蛋白质类杂质去除方法研究

曹红光，李燕妮

（1. 烟台东诚药业集团股份有限公司，山东 烟台 264006；2. 滨州医学院药学院，山东 烟台 264003）

关键字：硫酸软骨素；蛋白质杂质；蛋白酶水解；稀碱处理

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种结构复杂的糖胺聚糖，由D-葡糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺以β-1, 3糖苷键连接形成二糖（GlcAGalNAc），二糖单位之间以β-1, 4糖苷键连接而形成多聚糖[1-2]。CS广泛存在于动物组织的细胞外基质和细胞表面，尤其在软骨等结缔组织中含量丰富，不同生物或同一生物的不同组织所含CS的结构不尽相同[3]。

CS在透明软骨组织中是以聚集蛋白聚糖（aggrecan）糖链的形式存在的。聚集蛋白聚糖与胶原蛋白纤维等组分构成细胞外基质。胶原蛋白大约占干软骨重量的50 %～75 %，聚集蛋白聚糖大约占干软骨重量的15 %～30 %[4]。聚集蛋白聚糖聚集体的中心是一条透明质酸糖链，核心蛋白通过连接蛋白以非共价键与透明质酸连接。核心蛋白上连接着多条糖链，包括CS和硫酸角质素。CS和硫酸角质素共价连接在核心蛋白质上，见图1。所以CS产品中可能存在的天然杂质有蛋白质及其水解产物、透明质酸和硫酸角质素，本文重点讨论蛋白质水解产物的去除方法。

图1 软骨中胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的网状结构

蛋白水解酶消化方法已取代碱提取的方法用于将CS从软骨中释放出来。为充分降解蛋白质，应使用广特异性的蛋白酶。用胰酶或链酶蛋白酶处理软骨均可得到只含有少量残余肽段的多糖链[5]。基于酶的特异性不同，一般需要碱性、中性和酸性蛋白酶共同作用才可将蛋白质水解得比较彻底，在工业生产中一般使用碱性蛋白酶与胰酶共同使用的方法来水解软骨蛋白。通过蛋白酶的水解，切断蛋白聚糖中肽键后，CS从不溶于水的蛋白聚糖大分子变成溶于水的CS糖链。

工业生产中，使用适当浓度的乙醇可将CS先从溶液中分离出来，而蛋白质降解产物留在溶液中，从而实现分离和纯化。由于蛋白酶作用的特异性和多糖链的空间位阻会影响蛋白酶水解，只用蛋白酶不能断裂多糖与核心蛋白连接的糖苷键及附近肽键[6]，因此CS成品中可能保留肽段，这些肽段是通过共价键与硫酸软骨素连接在一起的，因此不能用乙醇沉淀的方法去除，需使用碱降解方法。在碱性条件下，多糖与蛋白连接区的糖苷键（即丝氨酸-O-木糖）会发生断裂，完全释放出CS[7]。本文采用稀碱处理方法，去除CS中蛋白质类杂质，从而获得高纯度CS。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 Infinity液相色谱仪（美国安捷伦）；Waters Spherisorb S5 SAX色谱柱（4.0 mm×250 mm）；UV 2550紫外分光光度计（日本岛津）；S20 pH计（梅特勒-托利多）； AVANCE IIITM 500核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。

1.2 材料

猪软骨（鼻骨，购于农贸市场）；硫酸软骨素对照品，硫酸软骨素ABC酶（Sigma公司）；无水乙醇，氢氧化钠，甲醛，盐酸等试剂（分析纯，上海试剂一厂）；胰酶（2000 U/g，重庆奥力）；Alcalase 3.0 T碱性蛋白酶（诺维信）。

2 方法

2.1 蛋白酶水解和乙醇沉淀方法去除CS中蛋白质

取1 kg鲜新软骨，匀浆后加入6.0 L纯化水，调节pH 7.5～8.0，加入一定量的碱性蛋白酶和胰酶，50 ℃水解10 h。每小时取样检测氨基氮含量。调节pH 6.0，85 ℃处理10 min。水解液离心，去除不溶物，0.8 μm微孔滤膜过滤澄清。水解液中加入2 %（w/v）氯化钠，1.2倍体积无水乙醇，沉淀，重新加水溶解为6.0 L，加入2 %（w/v）氯化钠和1.2倍体积无水乙醇，离心得CS沉淀，烘干。

2.2 碱降解法去除CS中的核心蛋白

将5.0 g上述实验得到的CS样品溶解成1000 ml（含NaBH41.0 mol/L，分别含NaOH 0.01 mol/L，0.05 mol/L和0.1 mol/L），45 ℃处理48 h[8]。用盐酸调节pH 6.5，加入4倍体积无水乙醇得到CS沉淀，烘干。

2.3 氨基氮含量测定

蛋白酶水解到一定时间时，取10 ml水解液，快速用冰水降温到10 ℃以下，离心后取上清，准确吸取5 ml，加20 ml纯化水，用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/L）滴定至 pH 8.2。向上述溶液中准确加入甲醛10 ml，混匀，放置3～5 min，用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/L）滴定至pH 9.2。记录消耗的氢氧化钠标准溶液体积。

氨基氮含量（mg/ml）＝C×VNaOH÷V样品×m

式中：C为氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）；VNaOH为滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；V样品为量取样品的体积（ml）；m为氮原子摩尔质量，14。

2.4 蛋白质含量测定

按中国药典福林酚法测定[9]。

2.5 CS含量测定

按中国药典酶解液相法测定[10]。样品经硫酸软骨素ABC酶充分消化后，用强阴离子交换色谱柱分离二糖组分，对二糖组分峰面积积分来确定CS含量。

3 结果与分析

3.1 蛋白酶水解和乙醇沉淀方法去除硫酸软骨素中的蛋白质

为了对比工业化生产中常用的碱性蛋白酶和胰酶两种酶的水解特性，单独使用0.8 %（按软骨重量计）碱性蛋白酶和0.8 %（按软骨重量计）胰酶对软骨进行水解。通过检测水解液中氨基氮的含量来检测水解程度，见图2。

图2 碱性蛋白酶和胰酶单独使用对软骨的水解特性对比

水解过程中碱性蛋白酶更快地完成水解，仅需大约2 h即可水解较彻底，而胰酶10 h内一直保持较缓慢的水解过程，这对工业化生产是不利的。尽管胰酶水解速度较慢，但是对蛋白质的水解更为彻底，因此在水解9 h后，其水解程度最终超过碱性蛋白酶。因此推测两种蛋白酶合用，可达到减少水解时间和增加水解程度的目的。

为了证明上述推论，将两种蛋白酶均按软骨重量的0.2 %，0.4 %和0.8 %的比例混合后同时使用，通过检测水解液中氨基氮的含量来检测水解程度，见图3。

图3 碱性蛋白酶和胰酶合用对软骨的水解特性

碱性蛋白酶和胰酶合用时的水解曲线与碱性蛋白酶单独使用时类似。由图3可见，3个水平的酶用量均可在水解2～4 h后接近水解终点，并且氨基氮的最终含量比单独使用碱性蛋白酶的水平稍高，水解速度比单独使用胰酶更快。

为评价蛋白酶水解程度对最终CS产品中蛋白含量的影响，取0.8 %碱性蛋白酶和0.8 %胰酶联用水解液，两次乙醇沉淀后检测CS产品中CS含量和蛋白质含量，见表1。

表1 水解程度对最终产品中CS和蛋白质含量的影响

随水解时间的增加，乙醇沉淀后所得产品中CS含量增加，蛋白质含量降低，但水解4 h后这种变化不再显著而慢慢趋于稳定。这个变化趋势与软骨的水解程度随时间的变化趋势一致。

乙醇沉淀是从溶液中分离多糖的一个简单途径，这个过程可去除大部分的小分子物质，包括肽和无机盐。实验发现重复的乙醇沉淀可大幅去除蛋白质水解产物，但当CS中的蛋白质含量降低到一定程度，如1 %～3 %时，重复乙醇沉淀就无法继续降低蛋白质含量。这是因为与碱解会不同程度破坏CS分子结构不同，蛋白酶水解的方法可获得完整的CS多糖分子，但获得只结合一个氨基酸残基的多糖几乎是不可能的。用木瓜蛋白酶彻底水解软骨获得的CS分子中含残留肽段，平均由5个氨基酸构成。与此相似的是，链酶蛋白酶水解后获得的CS也包含具有数个氨基酸的肽段[12]。这些肽段来自于CS在生物体内合成时，作为起点的核心蛋白。由于肽段与CS以共价键连接，并非游离形式存在，因此无法用乙醇沉淀等方法简单去除，需使用碱降解方法。

3.2 碱降解法去除CS中的核心蛋白肽段

碱降解过去常被用于从组织中提取多糖。用此方法从软骨中提取CS，产品具有较高纯度，但在碱处理过程中一些糖苷键被切断[13]。为在可控条件下尽可能断开连接区的肽段，采用不同浓度的氢氧化钠处理含蛋白质的CS样品，这些样品的蛋白质含量无法通过乙醇沉淀的方法继续降低。碱降解后，样品中CS含量和蛋白质含量的变化见表2。

表2 碱降解对CS含量及蛋白质含量的影响

碱降解后，CS中蛋白质的含量明显降低，同时CS含量发生不同程度的提高，接近最高值，这与其含有的蛋白质杂质含量降低有关。此实验证明，适量的碱降解可去除CS中无法通过乙醇沉淀去除的核心蛋白。

核心蛋白的含量可通过13C-NMR中56.4 ppm处丝氨酸信号峰检测[14-15]，见图4。由图4可见，经0.1 mol/L碱处理后样品的丝氨酸信号峰消失。

图4 CS核磁共振碳谱（部分）

碱降解是通过β消除反应切断蛋白聚糖连接区木糖和丝氨酸羟基之间的-O-糖苷键。碱处理可在有硼氢化物存在的还原环境下进行，它可使木糖残基还原成木糖醇，从而有效地阻止进一步降解。

4 讨论

目前酶解法成为从生物组织中释放多糖的最普遍的工艺。由于蛋白酶作用的特异性和多糖链本身会阻碍蛋白酶酶解，只用蛋白酶往往不能断裂糖苷键附近的肽键，因此CS成品分子中可能保留一定长度的肽段。使用胰酶或碱性酶蛋白酶水解软骨可得到含少量残余肽段的CS糖链。

尽管碱提取已不再用于任何大规模的多糖制备，对于CS等多糖来说，打开其还原端的木糖-丝氨酸连接，使其释放出最后连接的肽段，碱降解仍是一个有价值的方法。