用低分子量聚乙烯亚胺改性柞蚕丝素蛋白

汪巍巍，李明忠

(苏州大学纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215123)

柞蚕丝是野蚕丝中常见的品种，在我国柞蚕丝有较大的产量。柞蚕丝素蛋白(ASF)具有生物相容性好，可生物降解等优点，近年来受到极大的关注[1-3]。柞蚕丝素蛋白分子含有丰富的化学反应位点[4-5]，为改性柞蚕丝素蛋白提供了可能。大量研究表明柞蚕丝素蛋白含有较多的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，它能与多种细胞表面大量表达的αvβ3和αvβ5整合素受体靶向结合[6]。因此，柞蚕丝素蛋白用作生物医学材料的研究和开发应用前景广阔。

聚乙烯亚胺(PEI)是一种阳离子聚合物，目前广泛用作基因传递载体[7-8]。利用高分子量PEI(分子量：25 kDa)作为基因传递载体，虽然基因转染效率较高，但存在细胞毒性较大，不易被降解等缺点[9]。相比之下，低子量PEI的细胞毒性比较小。将分子量为1 800 Da的PEI接枝到牛血清蛋白上，得到的阳离子化牛血清蛋白(CBSA)能够有效地将DNA包裹和压缩成50～200 nm微球，体外细胞转染实验表明，CBSA/DNA复合物的转染效率与 25 kDa PEI相当，同时表现出较低的细胞毒性[10]。

柞蚕丝素蛋白在中性环境下带负电荷，不能直接用于包被、压缩核酸质粒[11]。若要赋予柞蚕丝素蛋白包被、压缩核酸质粒的能力，从而用作基因传递载体，则需使其表面带大量的正电荷。在我们的前期研究中[12]，曾用精胺对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性，但由于精胺所带氨基较少，当精胺加入量为6 %时，改性后柞蚕丝素蛋白溶液Zeta电位仅为 +8.4 mV左右。用低分子量PEI改性柞蚕丝素蛋白，有望使柞蚕丝素蛋白表面带更多的正电荷，更好地达到包被、压缩核酸质粒的作用。本文用碳化二亚胺(EDC)介导柞蚕丝素蛋白侧链上的羧基与低分子量(1 800 Da)PEI上氨基的反应，将PEI接枝于柞蚕丝素蛋白的侧链，使柞蚕丝素蛋白表面带上大量正电荷，从而获得经PEI改性的阳离子化柞蚕丝素(CASF)。

1 材料与方法

1.1 低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白的改性

首先按照文献报道的方法，制备柞蚕丝素蛋白溶液[12]。然后将50 mL柞蚕丝素蛋白溶液(10 mg/ mL)分别装入8个烧杯中，加入占柞蚕丝素蛋白质量0、0.1%、0.5%、1%、2%、4%、6%和8%的PEI(10 mg/mL)；使用HCl溶液(0.1 mol/L)调节其pH值至7.5～8.0；随后加入EDC，其质量为柞蚕丝素蛋白质量的20%；冰浴条件下反应过夜；在 4 ℃条件下用去离子水透析4 d；透析完毕后， 5 000 r/min离心30 min，取上清溶液，获得改性后柞蚕丝素蛋白溶液。

1.2 Zeta电位测试

取适量柞蚕丝素蛋白溶液和改性后柞蚕丝素蛋白溶液装入Zeta电位槽中，用马尔文粒径电位分析仪(Malvern Nano-ZS90)测定Zeta电位，测试重复次数设为3。

1.3 X-射线光电子能谱测试

将20 mL柞蚕丝素蛋白溶液和改性后柞蚕丝素蛋白溶液分别冷冻、干燥，再将样品剪成微细颗粒，用150目筛网筛下颗粒，压片制样，用X-射线光电子能谱仪(Axis Ultra HAS)分析样品表面的化学组成。

1.4 圆二色光谱测试

稀释柞蚕丝素蛋白溶液和改性后柞蚕丝素蛋白溶液分别至1 mg/mL，取3 mL加入到石英比色皿中，用圆二色光谱仪(Model410AVIV)室温检测190～250 nm波长范围内样品的摩尔椭圆度，分析经PEI改性对柞蚕丝素蛋白二级结构的影响。

1.5 核磁共振氢谱测试

室温下，用500 μL重水溶解冷冻干燥后的柞蚕丝素蛋白、改性后柞蚕丝素蛋白及PEI(约5 mg)，再装入干净的核磁管，用核磁共振仪(Bruker AV300-MHz NMR)进行核磁共振氢谱测试。

2 结果与讨论

2.1 柞蚕丝素蛋白与PEI的反应原理

图1 PEI改性柞蚕丝素蛋白的反应原理示意图

低分子量PEI阳离子化改性柞蚕丝素蛋白的反应原理，如图1所示。中性条件下，柞蚕丝素蛋白大分子的天门冬氨酸和谷氨酸侧链上的羧基(-COOH)基团容易失去H+，电离成―COO-，使柞蚕丝素蛋白表面带负电荷。柞蚕丝素蛋白侧链上羧基与碳化二亚胺上的碳氮双键(-N=C-)反应，形成O-异酰脲衍生物。不稳定的O-异酰脲衍生物再与PEI上的伯氨基反应，形成新的酰胺键。最终，改性后的柞蚕丝素蛋白带有大量的氨基，使其表面带上正电荷。

2.2 改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位

图2 PEI改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位

经低分子量PEI改性前后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位如图2所示，柞蚕丝素蛋白的Zeta电位为-7.24±0.38 mV。随着PEI加入量的增加，改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位呈现先增大后略有减小的趋势。用占丝素蛋白质量0.5%的PEI进行改性，改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位从负值翻转为正值(+1.37±0.54 mV)，表明经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的表面带上正电荷。用占丝素蛋白质量4%的PEI进行改性，改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位达到+11.4±0.22 mV。之后，随着PEI加入量的增加，改性后柞蚕丝素蛋白的Zeta电位略有减小，表明反应可能接近饱和状态。因此，可用占柞蚕丝素蛋白质量4%的PEI对柞蚕丝素蛋白进行改性，并进行后续实验研究。

2.3 改性后柞蚕丝素蛋白的X-射线光电子能谱

(a)柞蚕丝素，(b)改性后柞蚕丝素图3 PEI改性后柞蚕丝素蛋白的X-射线光电子能谱

表1 PEI改性后柞蚕丝素蛋白的元素分析表

图3为经PEI改性前后的柞蚕丝素蛋白的表面元素含量变化，表1为经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的元素分析表。与改性前柞蚕丝素蛋白相比，经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的O/C元素比由0.41减小到0.36。柞蚕丝素蛋白侧链上的羧基(-COOH)基团与PEI上的氨基形成新的酰胺键消耗O元素，因此O/C元素比减小。而N/C元素比由0.29增大到0.33，因为PEI(NH2-R-NH2)是一种阳离子聚合物，含有大量氨基，N元素含量较高。丝素蛋白表面元素的变化说明，PEI有效地与柞蚕丝素蛋白发生了反应。

2.4 改性后柞蚕丝素蛋白的圆二色光谱

(a)柞蚕丝素，(b)改性后柞蚕丝素 图4 PEI改性后柞蚕丝素蛋白的圆二色光谱

本文用圆二色光谱仪检测改性前后柞蚕丝素蛋白分子构象的变化。由图4可知，改性前柞蚕丝素溶液在207 nm和221 nm附近都有较强的负峰出现，如图4(a)，这两处负峰为α-螺旋的特征峰[13]，说明柞蚕丝素蛋白溶液分子构象以α-螺旋为主，含少量无规卷曲。由图4(b)可见，改性后柞蚕丝素蛋白在198 nm附近出现正峰，而同时在218 nm附近出现负宽峰，这两处均属于β-折叠的特征峰[13]。由此可以看出，经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的分子构象发生了由α-螺旋和/或无规卷曲向β-折叠的显著转变。

2.5 改性后柞蚕丝素蛋白的1H-NMR谱

图5 PEI改性后柞蚕丝素蛋白的1H-NMR谱

通过1H-NMR检测改性前后柞蚕丝素蛋白氢核的化学位移来推测PEI与ASF是否成功偶联。图5中PEI的1H-NMR谱上，化学位移在a(～2.65×10-6)处为-NHCH2CH2-共振吸收峰，与文献[14]的测定结果一致。在ASF的1H-NMR谱上，化学位移在b(～1.4×10-6)处的单峰为丙氨酸(Ala)上氢的共振吸收峰，化学位移在c(～3.8×10-6)处的单峰为缬氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)上氢的共振吸收峰，化学位移在d(～3.2×10-6)处的多重峰为天门冬氨酸(Asp)上氢的共振吸收峰，化学位移在e(～4.2×10-6)处的单峰为丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Ser)上氢的共振吸收峰[15]。观察阳离子化柞蚕丝素(CASF)的1H-NMR谱，所有ASF的特征共振吸收峰在CASF的1H-NMR谱上均有出现。并且在CASF的1H-NMR谱上，化学位移在 f(～3.25×10-6)处出现了微弱的新峰，它是-CONHCH2CH2NH-结构中紧邻酰胺键的亚甲基质子峰[16]，说明柞蚕丝素蛋白上的-COOH与PEI上的-NH2发生了反应，生成了新的酰胺键。在CASF的1H-NMR谱上，PEI中未参加反应的基团(2.4～2.7×10-6)保留了下来，同时发生了偏移[17]。

3结论

在碳化二亚胺的介导下，用低分子量聚乙烯亚胺改性柞蚕丝素蛋白。当PEI占柞蚕丝素蛋白质量4%时，改性后柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位为+11.4±0.22 mV。X-射线光电子能谱测试结果表明，经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的O/C元素比减小，而N/C元素比增大。圆二色光谱分析显示经PEI改性后柞蚕丝素蛋白的分子构象发生了明显转变。1H-NMR 测试结果分析表明，PEI与柞蚕丝素蛋白反应后生成新的酰胺键。上述结果说明，在碳化二亚胺的介导下，PEI上的氨基可与柞蚕丝素蛋白侧链上的羧基反应，使得柞蚕丝素蛋白表面的电荷由负电荷翻转为正电荷，从而制得阳离子化柞蚕丝素。低分子量聚乙烯亚胺改性的柞蚕丝素蛋白具有作为一种新基因传递载体的可能。