不同磷质量浓度营养盐对斜生栅藻生长及其碳、氮、磷组成的影响

罗晓霞， 云永超， 李长玲， 张 锐

(1 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2 广东海洋大学，广东省藻类养殖及应用工程技术中心，广东 湛江 524088；3 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518108；4 海南禄泰海洋生物科技有限公司，海南 文昌 571300 )

在“藻类—浮游动物—鱼类”的水生食物链中，藻类(初级生产者)是食物链中最底层的基础元素的提供者，是草食性浮游动物产量的限制因子之一，而浮游动物的产量则影响了最上层营养级鱼类的产量[1-2]。藻类的氮(N)、磷(P)含量决定了其作为浮游动物的食物质量[3-6]。相关研究发现：N、P缺乏会影响藻类的脂肪酸成分，导致藻类的多不饱和脂肪酸PUFAs(Poly Unsaturated Fatty Acids)降低[1,7-8]，从而限制浮游动物的产量[9-11]；高N含量小球藻培养的透明溞(Daphniahyalina)的内禀增长率比低N含量小球藻组更高[11]；当摄食的藻体 P含量降低时，大型溞(Daphniamagna)的生长率也随之下降[5]；藻体N含量越低，浮游动物的稳定同位素δ15N值越高，浮游动物摄食不同N含量的同一种藻类时，其稳定同位素δ15N值变化范围为0‰～6‰[12]。因此，藻类的N、P含量变化影响水生食物网的生产力及营养级判断。水体中营养盐含量不仅影响藻类的生长率，同时还影响藻类细胞的N、P组成[13]。对于不同氮、磷营养盐质量浓度对米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)[14]、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)[15]、刚毛藻(Cladophoraglomerata)[16]、小球藻(Chlorellasp.)[17]等藻类生长的影响已有相关报道。Hessen等[5]研究发现，随着磷营养盐质量浓度的增加，月牙藻(Selenastrumcapricornutum)自身的N、P含量越高。不同氮磷比(N∶P)营养盐培养的藻类的氮磷比也不同[11]。但是对于藻类在不同营养盐下，其藻体N、P含量的具体数值变化尚缺乏丰富的数据。

斜生栅藻(Scenedesmusobliqnus)是养殖池塘中浮游植物的优势种，不仅是浮游动物的优质食物来源，也是鲤鱼和草鱼等经济鱼类高产的关键[18-19]。本文研究了不同磷质量浓度营养盐对斜生栅藻生长和化学组成(碳、氮、磷)的影响，以期为养殖池塘水生食物网能量传递影响机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养基

斜生栅藻(Scenedesmusobliqnus)藻种由暨南大学水生所藻种室提供，采用蓝绿藻BG11(Blue-Green Medium)培养液培养。培养液用密理博超纯水仪(Diect-Q3，Milllipore)配制，经高压灭菌后供培藻用。

1.2 试验设置

以BG11培养基配方为基础，配置成无磷培养基，再以三水磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)为磷源，通过添加不同体积的三水磷酸氢二钾，分别配制0.005 4、0.054、0.54、2.7、5.4和8.1 mg/L共6个不同初始磷质量浓度梯度的培养液组，同时设置无磷BG11培养液为对空白对照组，每梯度设3个平行。

1.3 接种培养

斜生栅藻培养10 d后，选处于指数生长期的藻进行试验。取不同磷质量浓度的培养液400 mL于1 000 mL 锥形瓶，在无菌操作台(VS-840K，苏州安泰有限公司)加入藻液20 mL，起始藻密度控制在20×104个/mL，置于光照恒温培养振荡器(TS-111GZ型，常州高德仪器制造有限公司)培养10 d。培养温度为(25±1)℃，光照度为56 μmol / (m2·s)，光暗比12 h∶12 h。试验结束时对藻类进行计数，测藻体干重及碳(C)、氮(N)、磷(P)含量。

1.4 斜生栅藻计数及大小测量

试验结束时，取20 mL藻液，加入鲁格试剂[20]固定保存，在光电显微镜下随机测量30个藻体细胞的大小[20]，并用血球计数板进行计数。

1.5 细胞干重测定方法

预先记录玻璃纤维滤膜(GF/F，沃特曼Whatman，450 ℃预燃烧4 h)的质量。用GF/F滤膜抽滤50 mL藻液，置于60 ℃烘至恒重并称重，记录下藻体和滤膜的总质量。

1.6 藻体N、P含量测量

氮、磷的测定方法分别按张允法等[21]、彭华波[22]的方法进行，用紫外分光光度计(UV-5500)进行测定。每个平行组取10 mL藻液离心，去除上层清液，再补充相同体积的超纯水，重复离心2次后，补充超纯水至10 mL，用吸管把藻液打均匀，然后取2 mL测藻体P含量，取1 mL测藻体N含量。

1.7 藻体C含量的测量

用GF/F滤膜(沃特曼Whatman)于450 ℃预燃烧4 h后,抽滤50 mL 藻液,于60 ℃条件下烘至恒重,经CHNS/O 元素分析仪(美国尼通公司)测其碳质量。

1.8 计算方法

藻类生长率μ用下式计算。

μ=(lnN2-lnN1)/t

(1)

式中：t—培养时间，d；N2—最终的藻细胞浓度，个/mL；N1—起始藻细胞浓度，个/mL。

1.9 数据处理方法

数据用SPSS 17.0 进行单因素方差分析,如果原始数据符合方差齐性,则运用Duncan多重比较方法(P<0.05)。

2 结果

2.1 不同磷质量浓度对斜生栅藻生长的影响

2.1.1 对斜生栅藻生长率的影响

不同磷质量浓度对斜生栅藻的生长率有显著的影响(P<0.05)(图1)。斜生栅藻的生长率随磷质量浓度的升高而升高，含磷质量浓度组的生长率显著高于空白对照组。磷质量浓度较高的0.54～8.1 mg/L组的斜生栅藻生长率显著高于低浓度组(0.005 4 mg/L和0.054 mg/L),是低浓度组的2.4倍。其中，2.7 mg/L 磷质量浓度组的生长率显著高于0.54 mg/L组。但是当磷质量浓度继续增大到8.1 mg/L时，斜生栅藻的生长率和5.4 mg/L组的差异不显著。表明斜生栅藻在磷质量浓度为5.4 mg/L时，其生长率已到达较高水平，即使磷质量浓度再继续升高，斜生栅藻的生长率增长不明显。

注：图中字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同

2.1.2 对斜生栅藻干重及细胞大小的影响

磷质量浓度对斜生栅藻的干重有显著的影响(P<0.05)(图2)。斜生栅藻的单位体积干重(mg/L)随着磷质量浓度的增加而增加(图2a)。当磷质量浓度为2.7 ～ 8.1 mg/L时，斜生栅藻的干重显著高于低质量浓度组(0.005 4和0.054 mg/L)。0.54 和2.7 mg/L磷质量浓度组的藻体单位体积干重差异不显著； 5.4和8.1 mg/L磷质量浓度组的藻体单位体积干重显著高于其他组，但是这两组的藻体单位体积干重差异不大。

斜生栅藻的单位细胞干重(mg/个)则与单位体积干重(mg/L)趋势相反，磷质量浓度越低，其单位细胞干重越大(图2b)，低磷质量浓度组(0.005 4和0.054 mg/L)及空白对照组的单位细胞干重达1.8×10-4mg/个，是较高磷质量浓度组(0.54～8.1 mg/L)的4.5～5倍。当磷质量浓度为0.54～8.1 mg/L时，单位细胞干重无显著差异，为0.34×10-4～0.39×10-4mg/个。

磷质量浓度越低，细胞个体越大，在磷质量浓度为0～0.054 mg/L时，细胞的宽度达4.88～6.5 μm，明显大于磷质量浓度较高组(2.2～2.5 μm)(表1)。

图2 不同磷质量浓度下斜生栅藻的干重

细胞大小磷质量浓度/(mg/L)00.005 40.0540.542.75.48.1长/μm12.8±0.513.0±1.812.1±1.610±1.811.5±0.311.6±0.412.4±0.1宽/μm6.5±0.36.4±0.94.88±0.12.5±0.42.4±0.42.4±0.12.2±0.1

2.2 不同磷质量浓度对斜生栅藻化学组成的影响

磷质量浓度对斜生栅藻藻体的P含量影响显著(P<0.05)(图3a,b)。斜生栅藻的P含量随着培养液的磷质量浓度的升高而升高。高浓度组(5.4和8.1 mg/L)的斜生栅藻的单位体积P含量显著高于其他浓度组(图3a)；磷质量浓度为2.7和0.54 mg/L组的斜生栅藻的单位体积P含量显著高于低浓度组(0.005 4 和0.054 mg/L)。斜生栅藻的单位细胞P含量在高浓度组(5.4和8.1 mg/L)达到最高值，为6.62×10-7～7.56×10-7mg/个(图3b)，是其他浓度组的2～5倍；当浓度为0.005 4～2.7 mg/L时，其细胞P含量无显著差异。

磷质量浓度对斜生栅藻藻体的N含量影响显著(P<0.05)(图3c,d)。 磷质量浓度较高的0.54～8.1 mg/L组的斜生栅藻的单位体积N含量显著高于低磷质量浓度组(0.005 4和0.054 mg/L)，其N含量是低磷质量浓度组的1.5倍，但是随着磷质量浓度的增加，斜生栅藻的N含量差异并不明显(图3c)。低磷质量浓度组(0.005 4和0.054 mg/L)斜生栅藻的单位细胞N含量则显著高于0.54～8.1 mg/L 磷质量浓度组，而0.54～8.1 mg/L磷质量浓度组的单位细胞N含量无显著差异(图3d)。

注:字母不同代表差异显著(P<0.05)

图4 不同磷质量浓度对斜生栅藻藻体

在不同磷质量浓度下，斜生栅藻藻体的C含量随着磷质量浓度的增加而逐渐增加，当磷质量浓度为0.54～8.1 mg/L时，其藻体的C含量是低磷质量浓度的1.2～1.8 倍(图4)。

磷质量浓度对斜生栅藻的化学组成比率有明显的影响。斜生栅藻的C∶N原子比在不同磷质量浓度梯度下差别不大，C∶N范围为11∶1～14∶1。藻体的C∶P、N∶P则随着培养液磷质量浓度的增高而急剧减少(表2)。培养液磷质量浓度由0.005 4 mg/L 增加至8.1 mg/L，其藻体的C∶P减少25倍，N∶P减少31倍。

3 讨论

3.1 不同磷质量浓度对斜生栅藻生长的影响

有研究表明，营养盐浓度是影响藻类生长的重要因素[13-14,23]。随着磷质量浓度升高，铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的藻细胞密度呈增加趋势[15]。小球藻在中高磷质量浓度的环境中生长率比低磷质量浓度的快[17]。本试验的结果与上述研究结果相一致，斜生栅藻单位体积干重及生长率均随着磷质量浓度的升高而升高(图1、2、3)。磷质量浓度过低会抑制藻类的生长[17]。本试验中，当环境中磷质量浓度低至0.005 4和0.054 mg/L时，斜生栅藻的生长显著受到抑制(图1)。因此，当磷质量浓度 0.54 mg/L时，磷为斜生栅藻的生长限制因素。研究表明，磷质量浓度过高也会抑制藻类的生长[14,17]。但本试验中并没观察到该现象，磷质量浓度最高的8.1 mg/L组与5.4 mg/L质量浓度组的斜生栅藻的生长无显著差异。原因可能是斜生栅藻细胞分裂速度有限，对营养盐的吸收效率也有限，因此尽管磷质量浓度更高，但是斜生栅藻的生长速度并没有明显的提高。

表2 不同磷质量浓度对斜生栅藻藻体化学组成比率的影响

不同氮磷比的营养盐对藻细胞的生长有明显的影响，而不同的藻类，其生长的最适氮磷比不同[23]。新月柱鞘藻(Cylindrothecaclosterium)在营养盐N∶P为160∶1 时，生长率最快；而青岛大扁藻(Platymonashelgolandica)和米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)分别在4∶1和80∶1的条件下生长率最佳[21]。丰茂武等[15]及张猛等[16]研究发现，当N、P质量比为40∶1时，铜绿微囊藻、刚毛藻(Cladophorasp.)的生长最佳。本试验中斜生栅藻的生长趋势随着培养液N∶P比的降低而升高，生长最佳的高磷质量浓度组(5.4和8.1 mg/L)所对应的培养液N∶P为46∶1和31∶1(表2)，与丰茂武及张猛等[15-16]的研究结果接近。本试验中，斜生栅藻在磷质量浓度为0.54 ～ 8.1 mg/L时能正常生长，其最佳生长磷质量浓度范围为5.4～8.1 mg/L。

在营养盐限制条件下，某些微藻的细胞形态会发生不同程度的变异，从而更加适应复杂的环境[24]。虽然低磷质量浓度组(0.005 4和0.054 mg/L)的斜生栅藻的单位体积干重(mg/L)显著低于其他磷质量浓度组(0.54～8.1 mg/L)，但是单位细胞干重(mg/个)则显著高于磷质量浓度较高组(图2)，表明在磷限制的情况下，斜生栅藻细胞密度减少，但是细胞大小增大。绿藻在磷缺乏的情况下，藻体自身会存储大量的碳淀粉颗粒，因此导致细胞个体增大。藻类在营养盐(氮、磷)限制的情况下，细胞个体的脂肪含量增高[25]。本试验中，发现低磷质量浓度组的斜生栅藻细胞个体增大、细胞壁明显增厚的现象。因此，微藻在磷限制的情况下，藻体细胞不仅形态发生变化，而且细胞的生化成分也会发生变化。

3.2 不同磷质量浓度对斜生栅藻生化组成的影响

水体中营养盐的含量不仅会影响藻类的生长率，同时还会影响藻类细胞的生化组成[5-6,13]。Hessen等[5]研究发现，月牙藻(Selenastrumsp.)藻体的C、N、P含量与培养液中的磷质量浓度呈正相关性。本试验发现，单位体积栅藻的C、N、P含量随着培养液磷质量浓度的升高而升高(图3)。当外界磷含量发生变化时，藻体自身磷含量也相应发生变化，这是藻类对外界环境的适应反应[5]。本试验中，低浓度组的单位细胞 P含量显著低于高浓度组，但是单位细胞N含量却显著高于高浓度组，表明细胞个体在P缺乏的情况下，为了体内生化平衡，会大量吸收N元素，这也是藻类自我调整的策略。

Redfield定律常被认为适用于海洋、湖泊等水体中浮游植物的生长，藻类细胞组成的原子比通常为C∶N∶P=106∶16∶1，该原子比值被称为Redfield比值[13,26-27]。然而，最近的研究发现海洋浮游植物的C∶N∶P比常常会偏离Redfield比值[28]。本试验中，在不同P质量浓度条件下，藻体的C∶N∶P原子比率不同(表2)。Goldman等[13]发现在没有营养盐限制、浮游植物生长率较高的水体，浮游植物的原子比通常趋向于Redfield比值。然而，当外部营养源、光照强度超过藻类生长所需的条件时，Redfield定律则不适用于藻类的原子比值[5,15]。本试验中，当磷质量浓度为2.7 mg/L时，藻体的C∶N∶P为148∶13∶1，最接近Redfield定律。而其他磷质量浓度高于或低于2.7 mg/L的浓度组，其C∶N∶P均明显偏离Redfield定律。因此，Redfield 定律只适用于没有营养盐限制且生长率较高的浮游植物。

磷缺乏会影响藻类的脂肪酸成分，导致藻类的多不饱和脂肪酸PUFAs(Polyunsaturated Fatty Acids)降低，而藻类PUFAs的含量决定了浮游动物的产量[1,7-8]。因此，当藻类的磷含量过低时，对于浮游动物来说是一种低质量食物[1,5,9-11]，尤其是对于磷需求量较高的枝角类[1,6,29]。许多研究发现枝角类对食物中磷含量需求的最低阈值为C∶P=150∶300[1,9,30]。本试验中，磷质量浓度为0.005 4～0.54 mg/L时，藻体的C∶P低于枝角类(Daphnia)的最低食物需求，为212∶1～1 520∶1。因此，初始磷质量浓度为0.005 4～0.54 mg/L 培养的斜生栅藻是一种低营养食物，不是浮游动物的适宜食物。环境中的磷质量浓度不仅影响藻类的生长及生化成分，而且影响更高营养级浮游动物。然而，不同磷含量的斜生栅藻对于浮游动物生长的影响还有待进一步研究证实，从而为水生食物网能量传递影响机制提供基础资料。

4 结论

磷质量浓度对斜生栅藻的生长有显著的影响(P<0.05)。斜生栅藻的生长率随着初始磷质量浓度的升高而升高。磷质量浓度低于0.54 mg/L为斜生栅藻的生长限制因素。斜生栅藻在磷质量浓度为0.54～8.1 mg/L时能正常生长，最佳生长磷质量浓度范围为5.4～8.1 mg/L。

磷质量浓度对斜生栅藻藻体的C、N、P有显著的影响(P<0.05)。斜生栅藻的单位体积C、N及P含量(mg/L)随着营养盐磷质量浓度的升高而升高。高磷质量浓度组的斜生栅藻的P含量显著高于低质量浓度组。低磷营养盐下，单位细胞N含量显著更高。

在不同磷质量浓度下，斜生栅藻的C∶N原子比差异不大，C∶P比及N∶P比则随着磷质量浓度的增高而急剧减少。当磷质量浓度为2.7 mg/L时，藻体的C∶N∶P比率接近Redfield比值。

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