酶解对鸡骨素美拉德反应 挥发性风味成分的影响

邓海莲,胡 蝶,邹婷婷,*,刘少敏,宋焕禄,潘文清,龚 林

(1.北京工商大学食品学院,北京 100048; 2.湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司,湖南常德 415401)

骨素是以动物鲜骨为原料,经粉碎、提取、分离、真空浓缩和高温杀菌等工艺抽提得到的风味抽提物,富含天然呈味物质,具有很强的风味增强效果,因此在日本、韩国等东南亚及西方发达国家得到广泛应用。目前我国许多肉制品和速食面生产厂家通过使用骨素来提高产品的等级[1-2],但骨素风味单一且香气不足,后期应用过程中需要做生香处理,而美拉德(Maillard)反应作为生香反应的主要方式对风味物质的形成起到重要的调节作用,是骨素精深加工的必要途径[3]。

对骨素制备美拉德反应香精最常用的处理方式就是酶解,董宪兵[4-5]等研究了鸡骨素开发过程中蛋白酶的选择和酶解工艺,发现鸡骨素中蛋白质含量高脂肪含量低,氨基酸种类齐全,有很大的市场应用前景。陈怡颖等[6]对鸡肉及其酶解液的挥发性风味成分进行了对比分析,发现酶解可以鸡肉中的挥发性风味物质。孙红梅等[7-9]研究了鸡骨素酶解液美拉德反应的工艺条件,并对鸡骨素及其酶解液的美拉德反应产物挥发性风味成分和滋味成分比较分析,发现酶解可以增加骨抽提物中多肽及游离氨基酸的含量,使后期美拉德反应得到的肉味香精风味更加圆润、醇厚,烤香味、脂香味、肉香味突出。张永生等[10]研究了酶解鸡肉对炖煮风味鸡肉香精的影响,酶解后的热反应香精风味明显,醇厚感好。多项研究表明,酶解可以增加鸡肉和鸡骨素基料的物质,使美拉德反应产物得到的香精更醇厚。但是,目前对比不同类型的鸡骨素与其酶解液的美拉德反应产物的挥发性风味成分的研究较少。

本文利用固相微萃取/气相色谱-嗅闻-质谱联用技术对鸡骨素及其酶解液的美拉德反应产物进行分析,来阐述酶解对骨素美拉德反应产物的挥发性风味成分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清汤型鸡骨素、白汤型鸡骨素、植物水解蛋白(HVP) 湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;复合风味蛋白酶(500 LAPU/g)、复合蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麦诺维信公司;D-(+)-木糖、甘氨酸 源叶生物科技有限公司;L-半胱氨酸、丙氨酸 河北百味生物科技有限公司;硫胺素(VB1) 河南兴源化工产品有限公司;核苷酸二钠(I+G) 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司;葡萄糖 青岛佰仁生物科技有限公司;C7～C30系列烷烃、2-甲基-3-庚酮 美国Sigma公司。

BSA224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅、JI-1精密增力电动搅拌器 国华电器有限公司;YX-18DJ型YX系列手提式压力灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司;7890A-7000B气相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司;Sniffer9000嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司;SPME自动进样手柄、SPME萃取纤维头(DVB/CAR/PDMS涂层) 美国Supelco公司;毛细管柱DB-Wax及DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国J&W公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡骨素酶解液的制备 清汤型鸡骨素蛋白质含量27.3%±0.3%,可溶性固形物含量42%,含2%油脂;白汤型骨素蛋白质含量7.8%±0.42%,可溶性固形物含量47.5%,含28%油脂。根据查阅文献[4,10-12]及实验室前期工作优化得到的工艺条件,鸡骨素酶解液制备条件:清汤型骨素加入4‰复合风味蛋白酶和6‰复合蛋白酶,在55 ℃水浴条件下酶解3h;白汤型骨素加入4‰复合风味蛋白酶和2‰复合蛋白酶,在55 ℃水浴条件下酶解6 h,在酶解过程中用电动搅拌器搅拌。

表1 鸡肉香精感官评价标准[9,13-14]Table 1 Sensory evaluation criteria for chicken flavor[9,13-14]

1.2.2 热反应香精制备方法 以鸡骨素、半胱氨酸和葡萄糖等作为基本物质,通过查阅文献[4,11-12]及预实验建立了一个热反应体系:在100 g体系中,VB1、甘氨酸、丙氨酸、I+G、L-半胱氨酸各1 g,葡萄糖2 g,木糖2.5 g,HVP 10 g,蒸馏水20 g,清汤型和白汤型鸡骨素美拉德反应产物(清汤MRPs1和白汤MRPs1)及鸡骨素酶解液美拉德反应产物(清汤MRPs2和白汤MRPs2)分别加入80 g未酶解骨素和骨素酶解液,在灭菌锅中110 ℃反应30 min。反应结束后,立刻将反应产物移出,静置1 d后,将清汤MRPs1、白汤MRPs1、清汤 MRPs2、白汤MRPs2,进行感官评价,并对其挥发性风味成分进行分析。

1.2.3 感官分析 来自北京工商大学分子感官科学实验室的9名有经验的成员(5女4男,年龄20～30岁)组成感官鉴评小组,对4种样品进行描述性风味感官鉴评并打分。感官鉴评分别从气味、滋味2个方面对样品进行综合风味感官评价,样品用蒸馏水稀释50倍,用水浴锅调整样品温度至37 ℃,品评员对样品进行品评。感官指标的评分采用10分制,从0分(未感知)至10分(特别强烈)气味强度逐渐增加。

1.2.4 风味物质提取方法 采用手动固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技术对MRPs1、MRPs2的挥发性香气化合物进行提取。在40 mL顶空瓶中分别加入10 mL样品、1 μL浓度为0.816 μg/μL的内标物2-甲基-3-庚酮溶液,混匀后密封。将样品置于60 ℃水浴中平衡20 min,插入固相微萃取纤维头(DVB/CAR on PDMS),顶空吸附40 min。萃取结束后立即将萃取头插入气相色谱仪进样口中,于250 ℃条件下解析5 min进样。每个样品在相同提取与检测条件下重复做3次平行实验。

1.2.5 气相色谱-嗅闻-质谱仪条件馏分分离 采用DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱。升温程序:初始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min 升温到200 ℃,保持0 min,再以10 ℃/min 升温到230 ℃,保持3 min,检测过程共41 min。气相色谱使用的载气为氦气;流速为1.2 mL/min;分流比1∶1。质谱条件:电子轰击(electron impact,EI)离子源,电子能量-70 eV,传输线温度280 ℃,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃,质量扫描范围m/z 35～350。

1.2.6 挥发性香气化合物的定性和定量分析 采用保留指数(retention index,RI)、NIST14谱库质谱检索以及对比嗅闻数据3种方法对未知挥发性香气化合物进行鉴定。挥发性香气化合物的RI值利用正构系列烷烃进行换算,计算公式为:

RI=100N+100n(tRa-tRN)/(tR(N+n)-tRN)

式中:N为待测香气化合物a左侧低碳数烷烃的碳数;n为a两侧的两个烷烃之间相差的碳数;tR为相应化合物的保留时间。

由于本实验只需对比定量,因此采用内标法进行半定量分析。每种化合物的浓度计算公式为:

Ci=Cis×Aj/Ais

式中:Ci为化合物浓度(μg/mL);Cis为内标浓度(μg/mL);Aj为化合物的色谱峰面积;Ais为内标物的色谱峰面积。

1.3 数据处理

用Microsoft Excel 2007数据处理软件处理数据及SPSS 11对结果进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 感官评价

对4种鸡骨素美拉德反应香精进行感官评价,在气味方面,MRPs1的油脂味、异味、硫臭味均高于MRPs2,而烤香、鸡肉味、焦糖味均低于MRPs2。在滋味方面,MRPs1的焦糊味、油腻味较高,而鲜味、肉味、醇厚感、后味都明显低于MRPs2。说明无论是清汤型还是白汤型,酶解对其香气滋味都有贡献,使反应产物的味道更加浓郁圆润。与孙红梅等[8-9]的研究结果类似,酶解处理增加了最终产物的烤香味、脂香味、肉香味,使整体风味更加圆润、浓厚。

图1 4种产物的气味雷达图Fig.1 Radar character of volatile flavor of four products

图2 4种产物的滋味雷达图Fig.2 Radar character of taste of four products

2.2 挥发性风味成分的测定

通过数据库检索,4种美拉德反应产物的挥发性风味成分如表2所示,共鉴定出 70种化学成分,主要为醛酮类、醇类、酸类、酯类、杂环类化合物等。在清汤MRPs1鉴定出29种挥发性风味成分,MRPs2鉴定出50种挥发性风味成分;在白汤MRPs1鉴定出38种挥发性风味成分,MRPs2鉴定出53种挥发性风味成分。清汤MRPs2所得挥发性风味成分比MRPs1多21种,其中杂环类的物质浓度变化最为明显,可能是清汤骨素蛋白含量较高,酶解后的游离氨基酸种类更加丰富。白汤MRPs2所得挥发性风味成分比MRPs1多15种,酶解后醛类物质相对含量减少,醇类物质更加丰富,其他类均有变化,总体上MRPs2的香气成分种类更加丰富,含量更高,可见酶解使香精味道更加浓郁饱满。

表2 鸡骨素及其酶解液美拉德反应产物挥发性风味成分的SPME/GC-O-MS分析Table 2 Volatile flavor compounds from MRPs1 and MRPs2 identified by SPME/GC-O-MS

续表

表3 鸡骨素及其酶解液美拉德反应香气成分相对含量对比Table 3 Comparison of relative content of volatile flavor compounds identified in MRPs1 and MRPs2

醛、酮类挥发性物质一般由脂肪酸降解产生[15]。清汤MRPs2检测到11种醛,相对含量33.23%,MRPs1检测到9种醛,相对含量39.98%;白汤MRPs2检测到18种醛,相对含量60.82%,MRPs1检测到13种醛,相对含量27.65%。两种鸡肉香精酶解之后醛类物质增多,但相对含量减少,酶解液中醛类物质含量减少可能是由于酶解的过程中鸡脂氧化程度受到抑制[11]。而白汤骨素脂肪含量高,醛类物质更加丰富。醛类物质一般阈值较低,具有脂肪香味,是肉类的特征风味物质[16-17]。Farmer[18]报道,壬醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛、2-十一烯醛等均是鸡肉特征香味化合物。MRPs1中醛酮类物质比MRPs2种类少,含量低;而2-甲基-2-丁烯醛、5-甲基呋喃醛、4-乙基苯甲醛、反-2-壬烯醛、2-十一碳烯醛则只出现在白汤MRPs2中,它们可能是赋予产品脂香风味的主要香气成分[19]。并且感官评价也证明白汤MRPs2具有浓厚的脂香味。研究表明,若从鸡肉、鸡汤萃取物中除去羰基化合物,会大大削弱萃取物的特征脂肪香(即鸡香味),而醛类物质阈值一般都低于其他羰基化合物,故其在鸡肉香气组成中占据重要的地位[20]。

挥发性化合物中的醇类可能来源于脂肪酸的氧化[21]。在醇类化合物中,直链饱和醇阈值较高,对风味影响不大,但不饱和醇阈值较低,对风味的形成有一定作用[22]。醇类化合物对美拉德反应产物的总体气味有协同效应[23],例如,反应产物中1-辛烯-3-醇具有蘑菇气味。清汤MRPs1中检测出醇类物质3种,MRPs2中检测出5种;白汤MRPs1中检测出醇类物质3种,MRPs2中检测出4种,可见MRPs1的醇类物质含量低于MRPs2。

酯类化合物中的内酯和硫酯阈值较低,其它的酯类阈值较高,一般认为对鸡肉香气无特殊贡献。酯类物质主要由脂肪氧化产生的醇和游离脂肪酸经酯化反应形成[24],C1～C10脂肪酸生成的酯具有典型的果香味,而长链脂肪酸形成的长链酯更多地表现出油脂味[25],能使香料整体风味更浓厚、协调。与 MRPs1相比,MRPs2中酯类的浓度含量更高,气味更加柔和。与清汤的相比,白汤中酯类的含量更高、种类更多,气味更加浓郁。

酮类化合物的阈值一般较高,对鸡肉特征风味的贡献较小,但有些是形成杂环化合物的重要中间体,对肉香形成起到不可忽视的作用[26-27]。清汤MRPs2中酮类物质的浓度为53 ng/g,几乎是MRPs1酮类物质的浓度27 ng/g的2倍。在白汤的两种产物中均发现具有植物芳香性的6-甲基-5-庚烯-2-酮,以及对香料的甜味和香味有强增效作用的3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮,但是白汤MRPs2酮类物质浓度更高。MRPs2 中的醛酮类物质使肉味香料的风味更加圆润、有层次感。Cross 等[28]证实,醛酮类化合物对产品中肉香味的构成起到不可替代的作用,从挥发性风味物质中除去羰基化合物后,肉品的特有风味消失。

酸类物质阈值较高,由醛酮类物质氧化或脂肪酸降解产生,能够有效地修饰风味,乙酸在80%以上的香精样品中均有检出[29],MRPs2的酸类化合物的种类较丰富。

呋喃类化合物和酚类化合物被认为是蒸煮鸡肉的主要香气成分[30-31]。烷基呋喃主要来源于不饱和脂肪酸的氧化,其中2-戊基呋喃主要来源于亚油酸或2-癸二烯醛的氧化,阈值较低,是肉品的重要风味物质[32,16]。MRPs2中呋喃类物质的浓度更高,白汤MRPs2中的2-戊基呋喃达10 ng/g。天然愈创木酚是鸡肉的特征香气成分,在MRPs2中的浓度约是MRPs1的2倍。酚类的种类基本相同,但MRPs2中的浓度较高。

Maillard反应产物中杂环化合物通常具有较低的阈值,多数具有烤肉香气[33]。例如杂环化合物中具有坚果味与烤香味的含氮吡嗪类化合物阈值较低,是挥发性风味成分中的重要组分[34]。清汤MRPs2含有9类吡嗪,MRPs1中含有3类吡嗪,且吡嗪的种类和相对含量明显少于MRPs2,感官评价中也能看出MRPs2的烤香味强度大于MRPs1。白汤MRPs2 含有5类吡嗪,MRPs1中含有3类吡嗪。除此之外,2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、3,5-二甲基-2-乙基吡嗪、2-甲基-3,5-二乙基吡嗪、3,6-二甲基-2异戊基-吡嗪只在清汤中检出,可能是因为这些杂环化合物来源于氨基酸和还原糖之间的美拉德反应,氨基酸(如脯氨酸)的热解及硫胺素的热解[35],而清汤骨素的蛋白含量较高。Maillard反应产物中阈值较低的含硫化合物也是肉类风味的重要来源[36],如4-甲基-5-羟乙基噻唑是已报道的对肉香风味具有重要贡献意义的杂环化合物[37]。

此外,本实验还检出少量的烃类化合物,一般认为对鸡肉香气无特殊贡献。有些可能是形成杂环化合物的重要中间体,有助于提升整体风味[38]。检测到的4-烯丙基苯甲醚对热反应香精的整体风味有一定作用,只在MRPs2中检出。

3 结论

本实验采用SPME提取挥发性风味成分,用气相色谱-嗅闻-质谱联用技术对其进行分析,发现无论是清汤骨素还是白汤骨素,酶解都可以增加骨抽提物中多肽及游离氨基酸的含量,使美拉德反应得到的肉味香料风味更加醇厚。与清汤MRPs2相比,白汤MRPs2的醛酮类物质种类更多,反-2-壬烯醛、2-十一碳烯醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮等特征香气成分只在白汤骨素中检出,可能是因为白汤骨素脂肪含量更高,容易发生脂肪酸的降解和氧化,使体系内挥发性肉香成分增加[39]。但是在杂环类物质中清汤MRPs2则更加丰富,例如2-乙酰基呋喃、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、3,5-二甲基-2-乙基吡嗪、2-甲基-3,5-二乙基吡嗪、3,6-二甲基-2-异戊基吡嗪等则只在清汤骨素中检出,这些物质可能是由氨基酸和糖发生反应产生的,对肉香味的形成起重要作用。由此可见,脂肪和氨基酸都对肉香味的形成起到不可忽视的作用。