羊肉火腿加工过程中脂质氧化及 内源抗氧化体系变化

王勇勤,郭 新,黄笠原,卢士玲,王 斌,王庆玲,*

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832003; 2.新疆绿翔牧业有限责任公司,新疆额敏834600)

新疆羊肉因绿色、无污染深受区内外消费者喜爱,然而目前羊肉主要以鲜食消费为主,羊肉加工制品及其他相关产品相对匮乏。羊肉火腿是新疆穆斯林民族的特色食品,在腌制、发酵、成熟过程中,脂肪和蛋白质在内源酶系的作用下,产生许多易于消化吸收的小分子物质,如小分子肽、游离氨基酸、游离脂肪酸等,并形成了大量挥发性物质,赋予了羊肉火腿特有的香味[1]。然而,目前羊肉火腿的加工多为手工作坊模式,加工过程对自然环境的依赖性较强,导致产品品质不稳定、风味差异大[2]。夏博能[3]研究表明传统金华火腿相较于现代化工艺金华火腿具有较好香味,但含有三甲胺氮等有害物质,存在安全隐患。

脂质氧化是传统发酵肉制品加工中的重要生化反应,脂质氧化程度与原料脂质组成、加工条件(温湿度)、光照等条件密切相关,适量的脂质氧化能够改善火腿风味,增加消费者接受度[4];而脂质氧化过度会产生不愉快气味,甚至氧化酸败,危害人体健康[5]。陆瑞琪[6]研究证明了金华火腿加工过程中脂质氧化在发酵初期迅速上升，并在风干期有最大值,成熟期略有回落的变化规律,张万刚等[7]对传统工艺和新工艺金华火腿中抗氧化肽进行研究,证明了传统工艺中有更高含量的抗氧化肽,但还原能力与新工艺抗氧化肽还原力相当。

本课题对羊肉火腿加工关键工艺点的脂质氧化及抗氧化体系能力进行评价,揭示火腿加工过程中脂质氧化及自身抗氧化能力对火腿品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜羊后腿 石河子市好家乡超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、甲基-β-环糊精(RMCD)、丙酮等 均为分析纯,新疆恒朝生物技术有限公司。

IKA-T25型高速分散器 上海巴玖实业有限公司;SP-725型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;X7型酶标仪 基因有限公司;FDU-1200型冷冻干燥机 日本东京Rikakikai公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊肉火腿加工工艺及取样 新鲜羊后腿→冷凉修整→加盐腌制→浸泡洗刷→晾挂→发酵→成熟→成品[8]。

操作要点:鲜腿4 ℃预冷48 h腌制,鲜腿重的6.5%盐量,每次间隔2 d分5次搓在鲜腿表面,0～30 d为腌制期,腌制温度为6 ℃、RH为65%;30～60 d为晾挂风干期,风干温度为10 ℃、RH为70%;60～90 d为发酵前期,发酵温度为20 ℃、RH为70%,90～120 d为发酵后期,发酵温度为25 ℃、RH为75%;120～180 d为成熟期,成熟温度为28 ℃、RH为70%,其中RH为相对湿度[8]。

取样:从六个关键工艺点取样,分别是原料腿(第0 d)、腌制期(第30 d)、风干期(第60 d)、发酵结束期(第120 d)、成熟中期(第150 d)、成熟结束期(第180 d)取样,置于-80 ℃冷冻保藏,备用。

1.2.2 氧化指标的测定

1.2.2.1 硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定 参照Flores M等[9]的方法进行测定。

1.2.2.2 过氧化值(POV)的测定 根据GB 5009.227-2016进行测定[10]。

1.2.2.3 羰基值、双烯值的测定 2 g肉样加入 40 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1,v/v),用高速分散器4000 r/min匀浆1 min,静置过滤,加入0.7% NaCl溶液8 mL振荡,静置 2 h,移去上层液体,将下层液体旋转蒸发除去有机溶剂,得到纯油样,精确称量后,以环己烷溶解油样,并以环己烷作为空白对照组,分别在215、275、232 nm 处测吸光度,羰基值、双烯值分别用A275/A215,A232/A215计算[11]。

1.2.3 抗氧化能力测定

1.2.3.1 样品处理 将各个时期样品破碎后冻干,充分去除水分后用于抗氧化能力的测定。取冷冻干燥后样品0.4 g于离心管中,加入10 mL正己烷-二氯甲烷(1∶1,v/v),25 ℃、150 r/min摇床震摇1 h后，3000 r/min离心5 min,收集有机相氮气吹干,残余物用于亲脂性抗氧化物质的测定;向离心管残渣中加入10 mL 80%乙醇,25 ℃、150 r/min摇床震摇1 h后，3000 r/min离心5 min,收集上清液并在氮吹仪下回收乙醇,残余物用于亲水性抗氧化物质的测定[12]。

向亲脂性提取物中加入0.5 mL丙酮和1.5 mL 7%甲基-β-环糊精(RMCD)溶液;向亲水性提取物加入2 mL pH7.4 的75 mmol/L的磷酸盐缓冲液;每组测定三组重复[12]。

1.2.3.2 还原力测定 向试管中依次加入pH6.6的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)2.5 mL,1.2.3.1样品溶液0.5 mL,1%铁氰化钾溶液2.5 mL,混合体系于50 ℃孵育30 min,快速冷却,再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,3000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL加入去离子水2.5 mL和0.1% FeCl3溶液 0.5 mL,放置 10 min,以蒸馏水作为空白对照,于700 nm处测定其吸光度[13]。

1.2.3.3 羟自由基清除率的测定 取1.0 mL邻二氮菲无水乙醇(1.865 mmol/L)溶液,加入1.0 mL 0.2 mol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液,混匀,加入1.2.3.1提取液1 mL,充分混匀后分别加入1.865 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液1.0 mL、0.1% H2O21.0 mL于试管中,测量各组样品溶液的吸光度值为As,以去离子水代替样品作为空白测量吸光度值为Ab,以去离子水替代0.1% H2O2作为损伤组,测其吸光度值为An,脂溶性和水溶性样品的测定过程相同[13]。样品羟自由基清除率按以下公式进行计算:

1.2.3.4 DPPH自由基清除率的测定 取20 μL 1.2.3.1水溶性样品,80 μL去离子水和100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液于96孔微孔板中,于37 ℃恒温孵育45 min,于517 nm波长下测定其吸光度值;脂溶性样品的测定:将上述操作中去离子水更换为80 μL的95%乙醇,其余条件和操作步骤相同,以Trolox为标准品建立回归方程(水溶性标准曲Y=-1.0244X+0.3681(R2=0.996);脂溶性标准曲线Y=-1.2205X+0.5002(R2=0.9969)),结果用Trolox当量浓度表示[12]。

1.2.3.5 ABTS自由基清除率的测定 取20 μL 1.2.3.1水溶性样品,80 μL去离子水和100 μL磷酸盐缓冲液稀释的ABTS溶液于96孔微孔板中,于37 ℃恒温孵育5 min后，于734 nm下测定其吸光度值;脂溶性样品的测定将上述操作过程中磷酸盐缓冲液更换为80 μL的95%乙醇,其余条件和操作步骤相同,以Trolox为标准品建立回归方程(水溶性标准曲线Y=-0.6635X+0.2557(R2=0.9969);脂溶性标准曲线Y=-0.6788X+0.6388(R2=0.9975)),结果用Trolox当量浓度表示[12]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 羊肉火腿加工过程中TBARS的变化

硫代巴比妥酸值是油脂氧化酸败的重要指标[14],对火腿加工过程中TBARS监测结果见图1。

由图1可知,羊肉火腿加工过程中TBARS值先呈现显著上升(p<0.05),而后下降并逐渐趋于平稳的变化趋势。从原料至风干期结束(60 d)，TBARS值呈现显著上升(p<0.05)并达到最大值0.34 mg/kg,其原因是腌制及风干期水分大量散失,水分活度降低,脂质氧化加剧,造成火腿中不饱和脂肪酸大量被氧化导致丙二醛不断累积[15];发酵期相较于风干期结束(60 d)，TBARS值略有下降,随后在成熟中期(150 d)至成熟期结束(180 d)趋于稳定,主要原因是风干期以后温度上调至20 ℃,温度的变化促进了部分内源蛋白水解产物向小肽、游离氨基酸转变[16],产生具有抗氧化功能的内源物质;此外醛类进一步氧化生成醇和羧酸等物质,也是硫代巴比妥酸值下降的原因[17]。

图1 羊肉火腿加工过程中TBARS的变化Fig.1 Changes of TBARS value during mutton ham processing

2.2 羊肉火腿加工过程中过氧化值(POV)的变化

氢过氧化物是油脂自动氧化的主要初级产物,POV值主要用来衡量油脂氧化初期的氧化程度,当油脂深度氧化时,氢过氧化物的氧化速度超过了生成速度,POV值则会降低[14]。

由图2可以看出,原料腿到风干期结束(60 d)，过氧化值(POV)迅速增长,但在发酵期结束(120 d)至成熟期结束(180 d)维持稳定。原料腿POV值较低,主要是由于原料中水分含量较高、脂质氧化较轻,随着腌制过程的进行肌肉内水分流失,油脂氧化加剧,POV值上升,后期维持平稳可能是由于初级氧化产物向次级氧化产物转化,也可能是脂质氧化程度维持平稳[18]。虽然脂肪初级氧化产物对产品风味不产生直接影响,但却是重要的风味前体物质,这些中间产物随着累积会进一步发生氧化反应生成酮、醛、酸等低分子物质[19],所以脂肪氧化是羊肉火腿风味的重要来源。本研究羊肉火腿中POV值(按脂肪计)小于国标所规定的0.25 mg/100 g[10]。

图2 羊肉火腿加工过程中过氧化值(POV)含量的变化Fig.2 Changes of POV content during mutton ham processing

2.3 羊肉火腿加工过程中羰基值和双烯值的变化

羰基值是衡量肉制品品质和质量的重要指标之一,是指油脂氧化分解生成的酮、醛等物质含量的多少[20],双烯值则是评价不饱和脂肪酸中共轭双键多少的指标[14]。

由图3可知,羰基值和双烯值整体呈上升趋势,与原料肉相比,双烯值在腌制期呈现明显下降,主要原因可能是腌制时间延长,羊腿内水分逐渐散失,不饱和脂肪酸发生化学性或酶促性氧化反应所致[20];双烯值在风干期结束(60 d)有最大值1.14,可能是风干期羊腿与空气中氧气充分接触而导致脂肪氧化程度加深;羰基值变化则较为平缓,在风干期结束(60 d)有最大值0.193,因为在成熟过程中羰基化合物会转化成醇及其他挥发性风味化合物,这体现了羊肉火腿风味缓慢形成的过程,此结果与马艳梅等[8]研究结果相似。

图3 羊肉火腿加工过程中羰基值和双烯值的变化Fig.3 Changes of carbonyl and diene values during mutton ham processing

2.4 火腿内源抗氧化体系还原力评价结果

对火腿加工中关键工艺点的水溶性及脂溶性抗氧化体系进行还原力测定,结果见图4。

图4 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物质还原力的变化Fig.4 Changes of reducibility of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由图4可知，水溶性抗氧化物质的吸光值呈现显著(p<0.05)下降,表明其还原力不断降低,其原因可能是具有抗氧化能力的蛋白(肽)在加工中尤其是成熟期发生氧化现象。脂溶性抗氧化物质的还原力先上升而在150 d后略微下降,并且在成熟中期(150 d)具有最强还原力,主要原因是在前期加工中，内源蛋白酶水解蛋白质产生的抗氧化小肽和氨基酸积累[16],而在成熟后期(150～180 d)，此类抗氧化物质逐渐转化成大量挥发性风味物质[21],因而还原力略有下降。

2.5 火腿加工过程中羟自由基清除率的变化

羟自由基是引起食品脂肪和蛋白质氧化的重要因素,影响食品的品质和货架期[22],对羊肉火腿加工过程中羟自由基清除率的测定结果见图5。

图5 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物质羟自由基清除率的变化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由图5可以看出，羟自由基清除率与抗氧化体系还原力具有类似的变化趋势,火腿的整个加工过程中,脂溶性抗氧化体系羟自由基清除率呈显著(p<0.05)上升趋势,在成熟结期结束时(180 d)有最大清除率24.2%,有研究表明可能是加工过程中蛋白水解产生了脂溶性小肽、氨基酸所致,如含有色氨酸,酪氨酸等带酚类基团的片段[23],具有较强的自由基清除效果。研究表明抗氧化肽分子中含脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸时,在清除自由基方面有重要作用[24]。水溶性体系的羟自由基清除率呈下降趋势,在成熟期结束(180 d)低至12.8%,其原因可能是加工过程中水分含量降低导致抗氧化能力的下降。此结果与邢路娟等[25]的研究略有差异,可能与加工原料、温湿度条件、实验环境等有关。

2.6 火腿加工过程中DPPH自由基清除率的变化

图6表示水溶性抗氧化物质和脂溶性抗氧化物质清除DPPH自由基的变化趋势。

图6 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物质DPPH自由基清除率的变化Fig.6 Changes of DPPH free radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由图6可知，在原料羊腿中水溶性抗氧化物的DPPH清除能力明显高于脂溶性抗氧化物质,可能是由于原料腿中水分含量较高,含有一些具有抗氧化能力的水溶性短肽和游离氨基酸[26]。加工过程中脂溶性体系的DPPH清除率持续增加,不仅是蛋白质水解产物积累的结果,可能与羊肉火腿加工中磷脂的变化也具有相关性。磷脂酰基链上的脂肪酸水解时产生的游离多不饱和脂肪酸也对抗氧化能力也具有一定贡献[27];成熟期清除率略有下降,与多不饱和脂肪酸的氧化有关。水溶性抗氧化物质在整个加工过程中明显下降,而脂溶性抗氧化物质则是有升有降,成熟期结束(180 d),水溶性抗氧化物质和脂溶性抗氧化物抗氧化能力相当。

2.7 火腿加工过程中ABTS自由基清除效果

ABTS法是一种用于体外测定物质抗氧化能力的方法。图7表示水溶性抗氧化物质和脂溶性抗氧化物质清除ABTS自由基的变化趋势。

图7 羊肉火腿加工中脂溶性和水溶性 抗氧化物质ABTS自由基清除率的变化Fig.7 Changes of ABTS free radical scavenging rate of lip-soluble and water-soluble antioxidant substances during mutton ham processing

由图7可知,脂溶性体系对ABTS的清除效果整体呈上升趋势,而水溶性体系呈下降趋势。脂溶性抗氧化物质清除ABTS自由基能力在发酵期结束(120 d)最强,主要原因是随着发酵期温度升高,羊肉火腿中内源蛋白酶活性逐渐增强,这大大加快了蛋白分解生成具有抗氧化能力的小肽和氨基酸的速度[28],抗氧化能力增强,增大了ABTS自由基清除能力;水溶性抗氧化物质在风干期结束(60 d)至发酵期结束(120 d)有微小上升,说明此阶段水溶性抗氧化物质生成速度大于氧化速度;在成熟期二者均呈下降趋势,可能与加工后期的脂质氧化和蛋白质氧化相关。

3 结论

通过对羊肉火腿关键工艺点POV、TBARS、羰基值和双烯值的研究来评价火腿加工过程中的脂质氧化现象,结果表明，火腿加工在风干期结束(60 d)达到脂质氧化的最高值,而在后期脂质氧化程度下降并趋于平稳;对水溶性及脂溶性内源抗氧化体系的测定表明，火腿加工过程中抗氧化能力呈现动态变化,脂溶性抗氧化体系较水溶性抗氧化体系表现出更高的抗氧化能力。