响应面法优化超声提取杏鲍菇皂苷

林国荣,吴毕莎,苏彩凤

(莆田学院环境与生物工程学院,福建省新型污染物生态 毒理效应与控制重点实验室,福建莆田 351100)

杏鲍菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹苍耳,隶属于担子菌亚门(Basidiomycete subdivision),层菌纲(Hymenomycetes),无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae),伞菌目(Agaricales),侧耳科(Pleurotaceae),侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇菌肉肥厚,营养丰富,具有杏仁香味和鲍鱼味,故称杏仁鲍鱼菇。其子实体色泽雪白,质地脆嫩,也称“雪茸”,又有“平菇王”、“干贝菇”、“草原上的美味牛肝菌”之美誉。杏鲍菇入药不仅有降血压和降血脂的作用[1]，还对某些肿瘤有预防和抑制作用[2],具有提高人体免疫力、抗动脉粥样硬化、抗氧化的功能[3],被称为新世纪的健康食品。杏鲍菇寡糖含量很丰富,与双歧杆菌共用,有改善肠胃功能和美容的效果[4]。皂苷(saponin)又称:碱皂体、皂素、皂甙、皂角苷或皂草苷。“皂苷”一词由英文名Saponin意译而来,英文名则源于拉丁语的Sapo,意为肥皂。皂苷(Saponin)是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷,由皂苷元和糖构成;除用作药物外,皂苷还可以作为高级化妆品和食品添加剂,如作为杀菌剂、抗氧化剂、发泡剂等,在化妆品和食品工业中具有广泛的应用。

关于杏鲍菇研究报道主要集中于品种选育、高产栽培及商品化等方面,而对于杏鲍菇皂苷的报道相对较少见。由于超声波辅助提取法具有方便、快速、简单、安全、易于实现工业化等优点[5-6],并且宁波等[7]运用响应曲面法优化超声波提取玉竹总皂苷的工艺研究和董妙音等[8]运用响应面法优化超声波辅助提取文冠果种皮总皂苷的工艺,这些前人研究都给超声提取提供了有力依据。本研究采用超声波辅助提取,响应面优化工艺，确定超声提取杏鲍菇皂苷的最佳条件,为杏鲍菇皂苷的发展前景提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇 市售,洗净、切片、置于80 ℃烘箱中烘干,用粉碎机粉碎过100目筛，粉末备用;香草醛、浓硫酸、甲醇等 均为分析纯;人参皂苷标准品 中国生物制品有限公司。

Sartorius BS 210S电子天平 Sartorius公司;UV 1240型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;SHB-III型循环水式多用真空泵 河南郑州长城科工贸有限公司;KQ5200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;雷磁pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称取人参皂苷15.0 mg,用甲醇定容至50 mL容量瓶中,配制浓度为0.3 mg/mL,分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5支具塞试管中,将试管置于冷水浴中,分别加入0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL甲醇后,再加入0.5 mL 0.5%香草醛和2.5 mL硫酸,振荡均匀,混合物静置反应15 min,冷却至室温,在另一试管中加入1.0 mL甲醇,其他条件与上述一致,作为空白对照。于OD580 nm处测定吸光度,以皂苷浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 皂苷含量的测定方法 采用香草醛—浓硫酸比色法测定，并稍作改进[9]。取10 mL干净试管,精密加入各提取液1 mL,0.5%香草醛溶液0.5 mL以及浓硫酸2.5 mL,振荡均匀,混合物静置反应15 min,冷却至室温。空白对照为水加入0.5%香草醛溶液和浓硫酸2.5 mL,测定OD580 nm吸光度,计算皂苷得率。

皂苷得率(mg/g)=(OD580 nm+ b)V/(5.0k)

其中:OD580 nm为试样的吸光度;b为标准曲线Y轴上截距;V 为滤液的体积,L;k为标准曲线的斜率;5.0 为每份杏鲍菇样品的重量,g。

1.2.3 单因素实验 采用单因素实验法从液固比、提取温度、超声提取时间及提取液pH四个方面研究杏鲍菇皂苷的超声波提取工艺。

准确称取5.0 g杏鲍菇粉末于250 mL锥形瓶中,固定其他三个条件如超声提取时间20 min、液固比10∶1 mL·g-1、提取温度65 ℃和提取液pH为6.2,以超声提取时间为10、20、30、40、50 min;液固比分别为5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1 (mL·g-1);提取温度为45、55、65、75、85 ℃;提取液pH为6.2(原液)、7.2、8.2、9.2、10.2;加水并用保鲜膜封口，超声辅助提取杏鲍菇皂苷。

1.2.4 响应面优化设计 在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理[10],将超声提取时间、液固比、提取温度和提取液pH各因素分别用A、B、C、D来代表,以杏鲍菇皂苷得率为因变量,采用四因素三水平的响应面设计法(见表1),确定最佳提取工艺条件。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and levels of RAS test

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 人参皂苷标准曲线的绘制

以人参皂苷浓度(μg·mL-1)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线如图1,吸光度Y与浓度X之间的回归方程为:Y=0.0062X-0.0207,R2=0.9972,线性范围为0～60.0 μg·mL-1。

图1 人参皂苷标准曲线Fig.1 Standard curve of saponins

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声提取时间对杏鲍菇皂苷得率的影响 由图2可知,超声提取时间为10～30 min时,提取率不断上升,而且上升趋势很快,30 min左右达到最高峰,造成这种现象的原因可能是：刚开始时物料与提取液充分接触,导致提取率越来越高;随后从30～50 min呈下降趋势,这是由于随着时间的延长,物料浸提产生的杂质给提取带来阻碍,导致得率下降。由图2可以看出,杏鲍菇皂苷的最适提取时间为30 min左右。

图2 超声提取时间对杏鲍菇皂苷得率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic extraction time on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.2 液固比对杏鲍菇皂苷得率的影响 由图3可以看出,当液固比为5∶1 mL·g-1时，杏鲍菇皂苷得率最低,可能是因为这时的液固比较低,溶剂不能完全把杏鲍菇粉末浸透;随后液固比由5∶1～10∶1 mL·g-1之间,皂苷得率不断上升,而在10∶1～15∶1 mL·g-1之间又呈下降趋势,且下降趋势比上升趋势稍缓慢,这是因为随着液固比的增大,提取液对杏鲍菇粉末的浸提已达到完全,且随着液固比继续加大,同时也增加了浸提液的蒸发，得率降低。综上结果,最适的液固比是10∶1 mL·g-1左右。

图3 液固比对杏鲍菇皂苷得率的影响Fig.3 Effects of liquid-feed ratios on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.3 提取温度对杏鲍菇皂苷得率的影响 从图4可知,温度为45～65 ℃时,杏鲍菇皂苷的得率不断上升,在65 ℃时达到最大,说明此温度下杏鲍菇皂苷得率达到最高,若继续加大液料比可能会造成杂质竞争、溶剂浪费等现象,从而使得率不升反降,所以在65～85 ℃时，得率呈缓慢下降趋势。因此,杏鲍菇皂苷的最适提取温度该是65 ℃左右。

图4 提取温度对杏鲍菇皂苷得率的影响Fig.4 Effects of temperatures on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.2.4 提取液pH对杏鲍菇皂苷得率的影响 由图5可以看出,当提取液pH在6.2～8.2之间时,杏鲍菇皂苷的得率呈上升趋势,在pH8.2处达到最大值后,在8.2～10.2呈下降趋势。由于皂苷的分子结构可能有羟基,呈酸性,可与碱反应成盐而溶于水,因此，当提取液呈碱性时有助于皂苷的析出。由结果可看出,杏鲍菇皂苷的最适pH是8.2左右。

图5 提取液pH对杏鲍菇皂苷提取率的影响Fig.5 Effects of pH on yield of Pleurotus eryngii saponin

2.3 杏鲍菇皂苷的提取工艺优化

2.3.1 响应面设计工艺 根据单因素实验及确定的四因素三水平,利用软件Design-Expert.8.05b(原版)进行Box-Benhnken设计,确定杏鲍菇皂苷的最佳提取工艺,设计及结果见表2。

表2 响应曲面法优化试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

2.3.2 响应面分析 根据响应面设计得到的响应值结果进行分析,对实验数据进行多次拟合回归,以超声提取时间(A)、液固比(B)、提取温度(C)和提取液pH(D)为自变量,杏鲍菇皂苷得率(Y)为因变量建立二次回归方程:

Y=-73.95+0.28A+2.90B+0.51C+9.50D-0.0008AB-0.00045AC+0.00075AD-0.0094BC+0.013BD+0.0093CD-0.0041A2-0.10B2-0.0034C2-0.61D2

中心组合方差分析见表3,由表3方差分析结果可以看出,此回归模型p<0.0001,为极显著,失拟项不显著(p=0.084>0.05),即表明此模型的拟合度较好,误差较小,因此可以使用该模型对杏鲍菇皂苷的提取进行分析与预测。回归方程中,一次项B为极显著(p<0.01),这说明响应面优化试验中所选择的液固比对杏鲍菇皂苷的得率均具有极显著影响;交互项AC、AD、BC、BD和CD是不显著(p>0.05);二次项B2、D2对得率Y的影响均为极显著(p<0.01),A2、C2对得率Y的影响均为显著(p<0.05)。

表3 回归模型显著性检验结果Table 3 Significance test for regression model

2.3.3 响应面优化分析图 各因素对杏鲍菇皂苷得率的交互影响曲面图及等高线图见图6～图11。由图6～图11可知,因素B对杏鲍菇皂苷得率的影响显著,固定其他因素在一定水平,发现杏鲍菇皂苷得率随液料比的增加而增大,表现为等高线变化最为陡峭;提取液pH次之,表现为等高线较为平滑。提取温度和超声提取时间影响最小,表现为等高线平滑。

图6 超声提取时间与液料比交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.6 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and liquid-feed ratio

图7 超声提取时间与提取温度交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.7 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and temperature

图8 超声提取时间与提取液pH交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.8 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of ultrasonic time and pH

图9 液固比与提取温度交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.9 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of liquid-feed ratio and temperature

图10 液固比与提液pH交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.10 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of liquid-feed ratio and pH

图11 提取温度与提取液pH交互作用的响应曲面图与等高线图Fig.11 Response of surface plots and contour plots of the extraction yield under the interaction of temperature and pH

由图11可知,提取液pH与提取温度对总皂苷得率影响较显著。总皂苷得率随料液pH的变化先快速上升后缓慢下降;随提取温度的变化呈先上升后下降的曲线关系。

2.4 提取工艺优化验证试验

根据响应方程回归设计,得到最佳提取条件:超声提取时间30.6 min，液固比11.5 mL·g-1，提取温度64.7 ℃，提取液pH8.4，皂苷得率最大值为3.28%。

根据实际操作要求即超声提取时间31 min,液固比11.5 mL·g-1,提取温度65 ℃,提取液pH8.4，进行3组平行试验,在最佳提取条件下分别测得三组杏鲍菇皂苷得率,取平均值得3.19%,与理论最大值3.28%极为接近,说明优化方案具有可行性。

3 结论

本试验在单因素的基础上,运用响应面设计优化原理,确定杏鲍菇皂苷最佳提取工艺条件为:超声提取时间31 min,液固比11.5 mL·g-1,提取温度65 ℃,提取液pH8.4,此时杏鲍菇皂苷得率为3.19%,且与预测值较为接近。以超声提取时间(A)、液固比(B)、提取温度(C)和提取液pH(D)为自变量,杏鲍菇皂苷得率(Y)为因变量建立二次回归方程。说明了试验可行性的同时,也为杏鲍菇皂苷的工业化制备提供了理论依据。