高原型牦牛口蹄疫快速诊断技术及三价疫苗效果分析

祁玉琴

（青海省海西州天峻县新源镇畜牧兽医站，海西 817299）

0 引言

牛口蹄疫危害严重，国际上各个国家也采取不同有效措施对疫情进行有效防控。我国自建国以来曾经爆发过5次大规模的口蹄疫，主要为A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒暴发流行。进入21世纪，亚洲一型口蹄疫病毒在我国境内呈现高发趋势，因此，需要对现有的疫苗进行有效的改良，研制保护性能更强的疫苗。

1 快速诊断技术

目前，高原型牛口蹄疫快速诊断技术，主要应用抗体检测试剂盒开展检测。在具体操作过程中，要严格按照抗体检测试剂盒的说明要求开展，具体内容如下。

1.1 试剂盒操作

第一，对样品进行稀释处理。在处理过程中，按照试剂盒中的使用说明书科学称量试剂，使用标准溶液进行严格稀释，并将稀释液作为阳性对照；第二，试剂盒加样。在操作过程中，设置了空白对照孔，标准孔和待检样品孔。准确标定50 uL样品，将其添加到酶标包被板，首先将稀释液40 μL滴加到待检样品的样品孔中，然后向该孔中再加入稀释液10 μL。用模板封装之后，放置于恒温保温箱内培育30 min，恒温箱内的温度，持续维持在37 ℃。在恒温箱内培养过程中，选择使用30倍的浓缩洗涤液，使用经过灭菌处理的蒸馏水，30倍稀释；第三，上述培养结束，将试剂盒的模板取出，将多余的反应溶液去除，充分干燥，在向每一个反应孔中加入洗涤液，作用30 s后将洗涤液移出，如此反复5次。然后选择使用酶标试剂，除了普通白孔不添加之外，其他各个孔加入50 uL。然后按照上述培养温度和培养时间培养后向其中加入浓缩液洗涤；第四，显色反应。在上述处理的培养物中加入显色剂，每个反应孔中先加入显色剂A，然后再加入显色剂B，每一个反应孔中各加入50 uL，充分混合之后，在适宜温度下，遮光培养15 min；第五，测定。选择450 nm的光波，分别测定各个反应孔的吸光度，在整个测定过程中，应该确保在添加终止液15 min内完成。

1.2 结果判定

根据试剂盒的操作说明，进一步判定试剂盒内的反应情况。如果抗体效价大于0.2，则判定为阴性；如果抗体效价维持在0.2～0.3之间，判定为可疑；如果抗体效价不小于0.3，则判定为阳性。在进行判定过程中，针对检测过程中发现的阳性样本和可疑样本，应该设置重复检验，复检验结果仍然为阳性的，才能判定为阳性。

2 三价疫苗免疫效果调查

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料选取

研究选择在青海省海西州天峻县新源镇3家牦牛养殖场进行。在3家养殖场中分别挑选不同年龄性别的牛，同时要保证牛为6月龄以上健康牛。疫苗选择由新疆天康畜牧生物技术有限公司生产的口蹄疫A型、O型和亚洲一型三价灭活疫苗。实验过程中主要使用到洗板机、酶标仪、量程加样器、超纯水、无离子水、包被缓冲液、洗涤液及底物溶液。

2.1.2 操作方法

首先，选择使用缓冲液，将与上述疫苗相对应的血清，稀释到指定的浓度，然后在设计板上，每个样孔中加入血清50 uL，密封后室温环境内作用一晚上[1]。将3个养殖场采集的待检血清56 ℃环境下灭火30 min；其次，抗原抗体反应。选择使用优型血凝板，按照每孔50 uL的用量，使用稀释液将20个待检血清从1∶16开始做2倍连续稀释，直到稀释滴度控制在1∶128。按照上述方法，将阴性血清和阳性对照血清稀释，在试剂盒的每一个孔中加入50 uL经过稀释到指定浓度的3种口蹄疫病毒抗原，同时在对照孔中，加入100 uL的病毒抗原，充分混合后，指定环境下密封培养24 h。确保加入病毒抗原后，是1∶32稀释度的两倍；再次，将反应平板用缓冲液反复清洗5次，干燥之后，将反应物依次转移到相应的孔中，然后向孔中滴加50 uL反应液，37 ℃温度下密封1 h。然后使用洗涤液，用缓冲液反复清洗5次，干燥之后，使用豚鼠抗血清进行充分稀释，稀释亚洲一型口蹄疫病毒，直到稀释到1∶1000的工作浓度，每个孔中加入50 uL，37 ℃密封培育1 h，按照上述操作方法使用稀释液将其稀释到1：1000的工作浓度，每孔加入50 uL，37 ℃密封培育1 h；最后，每孔加入50 uL底物溶液，37 ℃培养15 min，然后向其中再加入50 uL终止液，终止反应，立即在波长492 nm下读取其吸收值（OD值）。

2.1.3 判定

以口蹄疫病毒抗原对照平均OD值的50%为临界值[2]，被检血清大于临界值为阴性，小于或等于临界值为阳性。阳性孔OD值使所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度，如果临界值处于两者之间，取中间值。当牛的抗体效价不少于1∶128时，属于99%以上保护，抗体效价不大于1∶16时，属于不保护范围，需要进行基础免疫。抗体效价在1∶22到1∶90时，属于50%保护范围，需要强化免疫[3]。

2.2 结果

通过对青海省海西州天峻县新源镇3家牦牛养殖场122只免疫的牦牛定期采取血清进行免疫抗体滴度变化检测可以看出（见表1），牛群在免疫第1个月A型、O型和亚洲一型抗体滴度分别达到了1∶556，1∶129，1∶289，免疫第6个月后，除了亚洲一型抗体之外，A型和O型口蹄疫免疫抗体水平均高于免疫前。抗体滴度分别为1∶105，1∶99，1∶64。通过表1数据可以看出，口蹄疫A型、O型和亚洲一型三价灭活疫苗有效免疫期在6个月以内具有很好的免疫效果，但对于亚洲一型口蹄疫发生的地区，在免疫第6个月后，需要进行强化免疫。

表1 三家牦牛养殖场抗体滴度变化

通过对青海省海西州天峻县新源镇3家牦牛养殖场抗体滴度变化监测分析可以发现，口蹄疫A型、O型和亚洲一型三价灭活疫苗免疫之后1～2月抗体滴度几何均值最高，免疫3月后100%的牛A型抗体水平达到100%免疫保护率，80%以上牛O型和亚洲一型抗体达到100%免疫保护率。免疫6个月后，口蹄疫A型、O型和亚洲一型均不小于1∶64。由此可以看出，所使用的三阶灭活疫苗能够起到令人满意的保护效果。