皂素处理联合MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性病原菌*

张 蓓，赵丽娜，韩清珍，毛菊珍，张有涛，张险峰，何 军，徐 杰，史进方

(苏州大学附属第一医院临床检测中心，江苏苏州 215006)

近年来，经验性广谱抗菌药物的使用和侵入性诊疗等危险因素的增多，使血流感染日益成为患者院内致残和致死的主要病因[1-2]。充分利用先进的微生物鉴定仪以缩短血流感染鉴定时间，指导临床及时开展病原菌针对性治疗使患者预后良好具有重要意义[3-6]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)因能准确、快速地检测血培养中病原菌而在微生物实验室广泛使用[7-9]。与传统鉴定方法比较，直接鉴定阳性血培养有利于败血症患者得到更早、更有效的治疗[10-13]。本研究采用皂素处理阳性血培养液，使病原菌富集并纯化，然后利用MALDI-TOF MS对病原菌蛋白谱图进行鉴定分析，同时报道阳性的血培养瓶进行传统培养流程，培养的纯菌落也使用MALDI-TOF MS进行鉴定，若两者结果不一致，以后者为准。

1 材料与方法

1.1一般材料 收集2016年11月至2017年1月苏州大学附属第一医院240例血培养仪器报警患者(388例阳性仪器报警血培养瓶)标本，标本类型包括全血、静脉导管血。

1.2仪器与试剂 Bact/ALERT®3D 全自动血培养仪及其配套的血培养需氧微生物培养瓶(SA)和厌氧兼性厌氧微生物培养瓶(SN)均购自梅里埃(中国)公司。 48孔靶板和α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质液购自梅里埃(中国)公司。皂素、甲酸和乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司。质控校准菌株ATCC 8739由梅里埃(中国)公司提供。

1.3皂素提取法MALDI-TOF MS直接鉴定 生物安全柜内操作，采用2 mL无菌注射器提取800 μL仪器报警血培养液于含500 μL 4%皂素的1.5 mL离心管中颠倒混匀，室温放置3～5 min；10 000 r/min离心2 min，弃上清液；加入600 μL 0.9%生理盐水重悬沉淀，取1滴悬液涂片革兰染色镜检；再次10 000 r/min离心2 min，弃上清液；加入60 μL 70%甲酸(现用现配)，微量加样枪重悬混匀沉淀，室温放置3～5 min；加入60 μL乙腈，颠倒混匀，室温放置3～5 min，提取菌体蛋白；10 000 r/m离心2 min；吸取2 μL上清液加至Vitek MS 金属靶板孔，每个标本重复2孔，室温干燥；每孔加0.9 μL CHCA基质液，室温干燥。根据革兰染色涂片结果选择细菌和真菌进行质谱分析。

1.4血培养直接涂片与皂素处理后涂片染色镜检 (1)直接涂片染色镜检：从血培养仪中取出报警血培养瓶，涂片革兰染色镜检，记录是否存在微生物及其革兰染色性和菌体形态。(2)皂素处理后涂片染色镜检：取1滴皂素裂解红细胞处理后0.9%生理盐水重悬菌液涂片革兰染色镜检。

1.5传统血培养MALDI-TOF MS鉴定 血培养阳性标本转种于血琼脂平板，适宜环境中孵育18～72 h，若初次培养未见细菌生长，72 h后再次转种血培养阳性标本；挑取单菌落，涂布金属靶板孔中，采用Vitek MS微生物质谱鉴定系统进行鉴定。

2 结 果

2.1血培养直接涂片与皂素处理后涂片染色镜检结果比较 血培养直接涂片存在大量红细胞背景，存在难以区分革兰阴性杆菌与血细胞背景，以及过度染色、脱色等问题。皂素处理后涂片染色镜检时，镜下观察背景清晰，干扰较少，细菌革兰染色性和菌体形态典型，很容易找到革兰阴性杆菌。见图1。

注：A表示念珠菌；B表示阳性杆菌；C表示链球菌；D表示阳性球菌；E表示阴性杆菌

图1直接涂片与皂素处理涂片镜检图片比较

2.2皂素处理-质谱法直接鉴定血培养的微生物结果

2.2.1单菌株血培养共193例(剔除同一患者多例标本)，标本皂素处理-质谱法直接鉴定的符合率为69.9%(135/193)。革兰阴性杆菌的符合率为84.0%(63/75)，错误率为4.0%(3/75)。葡萄球菌属的符合率为78.5%(51/65)，错误率为6.2%(4/65)。肠球菌属的符合率为80.0%(8/10)，错误率为10.0%(1/10)。链球菌属的符合率为23.1%(3/13)，错误率为23.1%(3/13),未鉴定率为53.8%(7/13)。阳性杆菌的符合率为11.8%(2/17)，未鉴定率为82.4%(14/17)。念珠菌属的符合率为66.7%(4/6)；厌氧菌的符合率为100.0%(3/3)。见表1。

表1 单菌株血培养病原菌鉴定结果[n(%)或n]

续表1 单菌株血培养病原菌鉴定结果[n(%)或n]

2.2.2多菌株阳性血培养瓶共4例(剔除同一患者多例标本)，仅有2例鉴定出其中的1种病原菌；2例未鉴定出病原菌。

2.2.3240例仪器报警血培养瓶中有43例是培养阴性的标本，有37例鉴定结果与血培养结果一致，符合率为86.0%(37/42);其余6例鉴定为少见菌：堪萨斯分枝杆菌2例、格氏李斯特菌1例、玫瑰色库克菌1例、弯曲乳杆菌1例、生孢梭菌1例。

3 讨 论

本研究采用皂素裂解血培养瓶中红细胞及其他操作步骤进行富集并纯化菌体蛋白质，排除因血培养瓶中除有细菌外，还有人体血细胞、肉汤营养成分甚至树脂等干扰因素对后续质谱结果的影响[14]。与此法类似的有Sepsityper 配套试剂盒，但是成本昂贵[15-16]。

本研究结果表明，皂素处理-质谱法在单菌株阳性瓶革兰阴性杆菌、葡萄球菌属、肠球菌属、厌氧菌的鉴定符合率达75.0%以上，而且其相对于传统的培养鉴定流程可提前1～2 d鉴定结果，可以在血培养仪器报警的1～2 h内将病原菌鉴定结果报告临床。有研究报道，有效的抗菌药物治疗每延迟1 h，感染性休克患者出现低血压后的存活率平均下降7.6%，所以该方法对血流感染患者的治疗意义重大[3]。本方法鉴定符合率(69.9%)与分离胶促凝管联合MALDI-TOF MS方法的鉴定符合率(73.6%)基本一致，说明本研究方法的可行性[17]。但是还存在一些不足，链球菌属与阳性杆菌的鉴定符合率明显低于其他病原菌的鉴定，李媛睿等[18]对可能原因进行了分析：(1)革兰阳性球菌细胞壁结构相对较厚，不易裂解，提取的核糖体蛋白浓度不够。(2)蛋白结构高度相似，特征性峰谱较少，质谱难以区分。(3)生长缓慢，核糖体蛋白未充分表达。(4)菌体形态小，未能提取足够的蛋白。(5)某些患者血细胞压积过高，使抽取的血培养液的含量与皂素含量未达到一定比例，因此红细胞裂解不充分，干扰了鉴定结果。本研究更倾向于MALDI-TOF MS，由于其本身对链球菌属与阳性杆菌的数据库并不完善，限制了其鉴定。多菌株感染血培养瓶中，有2例鉴定出其中的1种病原菌；2例未鉴定出病原菌；虽然可以鉴定出其中1种，但是其鉴定率不高，复合菌均鉴定的比率更低，原因可能为2种菌体的核糖体蛋白互相干扰[19]。43例假阳性血培养瓶中，37例与传统鉴定结果一致，6例用皂素提取法联合MALDI-TOF MS鉴定出细菌，种类有堪萨斯分枝杆菌2例、格氏李斯特菌1例、玫瑰色库克菌1例、弯曲乳杆菌1例、生孢梭菌1例。这些细菌大多在自然环境和水中广泛存在，可能在操作过程中污染了这些菌，也可能是血培养瓶在抽取血液时被这些菌污染，由于数量少，传统鉴定方法未能鉴定出，因而出现结果不一致。所以，对鉴定出来的结果，还要参考革兰染色镜检结果进行综合评价。

与传统鉴定方法相比，皂素预先处理与MALDI-TOF MS联合有以下优点：(1)直接提取，操作简便。(2)检测快速，周转时间短，每份标本约为15～20 min。(3)鉴定范围广，基本涵盖临床常见病原菌。(4)结合革兰染色镜检结果，对临床治疗有重要的提示意义。有待改进的地方：(1)链球菌和阳性杆菌的鉴定率不高。(2)鉴定易受标本血细胞压积过高的干扰，可适当减少血培养液含量。(3)慢生长的细菌，存在菌含量不够的限制，菌量至少达到106CFU/mL才能获得较好的质谱峰[20]。

综上所述，采用皂素处理联合MALDI-TOF MS能快速、简便、准确地鉴定血培养的常见病原菌，且成本低廉，可行性高，适合在临床微生物实验室推广应用；同时满足临床对血流感染病原菌快速诊断的需求，临床医师可结合该院耐药性检测数据，及时对血流感染患者给予早期且有效的抗菌药物治疗，从而降低患者的院内致残率和致死率。