一例鸡新城疫病RT-P C R的诊断*

张文通 ，魏凤 ，李峰 ，王金良 ，苗立中 ，沈志强 ，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是由副粘病毒引起的禽类的高度接触性传染病。该病呈世界性分布，又称为亚洲鸡瘟[1-3]。以高度呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血为主要特征[1-3]，具有较高的发病率和致死率，对养鸡业危害严重。2018年4月，山东博兴县某鸡场发生了以呼吸困难、拉绿色粪便及腺胃出血等特征的疑似鸡新城疫疾病，现将诊治疗过程报告如下：

采用发病情况调查、临床症状、病理剖检、病原分离、RT-PCR诊断，确诊病原为鸡新城疫病毒。根据确诊结果，按照鸡新城疫病防治措施操作，鸡场发病情况立即得到好转。

1 发病情况

2018年4月初发现滨州博兴县某规模化蛋鸡场（存栏约1万只）有雏鸡（2～3周龄）开始零星发病，两三天波及全群，发病率达100%，病死率约30%。用抗生素治疗无效。

2 临床症状

呼吸困难，嗜睡，卧倒，拉绿色稀粪便；个别雏鸡临死前有神经症状。

3 病理变化

剖检病死鸡，结果发现：气管有粘液，肺脏出血，肝脏出血、腺胃乳头出血、淋巴结肿大出血，小肠出血。

4 病毒分离鉴定

4.1 病料采集 无菌取病死鸡肺脏、脾脏、淋巴结等。

4.2 病料处理 将采集的样品，按照样品与灭菌0.85%生理盐水 1∶3比例研磨；反复冻融；4℃12000r/min离心10min；吸取上清，将上清液用0.22μm一次性滤器过滤除菌；分装冻存于-80℃备用。

4.3 病毒分离 用上述过滤除菌病料尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。孵育结果为，24h内无死胚，收获接种后24～120h死胚尿囊液，分装。继续在SPF鸡胚上传至3代，并收获尿囊液备检。

5 病毒的RT-PCR鉴定

5.1 引物设计 根据GenBank报道的“KF306265”序列设计，扩增长度522bp，用于鉴定鸡新城疫病毒。引物序列如下：

上游引物：ATGGGCTCCAGACCTTCTACT；

下游引物：TTGTGATAATCCGTCGGTGA。

5.2 病毒的RT-PCR 提取3代胚尿囊液的RNA，并同时提取新城疫阴性胚毒及新城疫阳性胚毒的RNA（新城疫阴性、阳性胚毒来自山东绿都生物科技有限公司）。病毒RNA用大连宝生物提供的RNA提取试剂盒提取，一步法RT-PCR反应成分及反应程序见表1。

表1 RT-PCR反应体系

RT-PCR反应条件为：50℃反转录45min；94℃5min； 进 入 PCR 循 环 ，94℃ 45Sec，55℃ 45Sec，72℃ 45Sec，30个循环后，72℃延伸 10min。 反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

5.3 病毒的RT-PCR鉴定结果 琼脂糖凝胶电泳检测显示，病毒的RT-PCR扩增产物大小约522bp，与预期一致，见图1所示。

图1 病毒的RT-PCR扩增产物

回收RT-PCR产物，送往上海生物工程有限公司测序。测序结果与GenBank上报道的鸡新城疫核苷酸序列同源性最高达99%。

5.4 治疗措施 经上述诊断确认病原为鸡新城疫病毒。建议鸡场采取如下措施：①消毒及隔离措施。建议对发病鸡舍与受威胁鸡舍采取严格隔离措施，并进行全面、定期消毒；②紧急接种措施。购买正规厂家的新城疫疫苗，对本场所有鸡群进行紧急免疫；③无害化处理措施。对病死鸡，进行深埋或其他无害化处理措施；④药物辅助治疗措施。建议对所有鸡群采用对大肠杆菌敏感的抗生素进行预防或治疗，并给予Vc等药物用于提高机体免疫力。

养鸡场按照上述治疗措施进行操作，发病鸡群死亡率及发病率大幅降低。2周后病情基本缓解，鸡场进入稳定状态。

6 小结

通过与发病鸡场厂长进行沟通，该场进行过新城疫疫苗免疫。但免疫之前，未进行母源抗体测定，按经验进行免疫接种。另外该场生物安全措施几乎没有，人员未经消毒随意进入鸡舍，总之管理混乱。鸡舍内部未定期消毒，鸡舍环境较差。这三点可能是该场暴发鸡新城疫病的原因。