山东地区鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定及防治*

李浩然 ，李哲 ，孟凡生 **，刘世霞

（1.临沂大学农林科学学院，山东 临沂 276000；2.沂水县畜牧局，山东 沂水 276403）

鸡传染性支气管炎病毒 (Chicken infectious bronchitis virus，IBV)，属冠状病毒科，冠状病毒属的病毒，具有多形性，所引起的疾病是广泛流行的一种高度接触性传染病。目前，虽然已从鸽子和野鸡中分离到IBV，但公认鸡是IBV主要宿主，可对不同日龄的鸡产生不同程度的危害。IBV由于毒株不同分为呼吸性、肾性等10～15型。鸡肾型传染性支气管炎(infectious bronchitis，NIB)是由嗜肾型传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高致死性、接触传染的呼吸道传染病,肾脏损伤严重，而呼吸道损伤较轻，以肾脏肿大呈苍白色及肾小管内尿酸盐沉积为主要特征。鸡感染IBV的肾性毒株后，会发生间质性炎和呼吸道轻微症状，伴有中高程度的死亡率，在没有继发感染的情况下，病鸡死亡率一般较低。美国学者Winterfield R W等[1]于1962年在美国首次发现并分离到能引起鸡肾病变的IBV，1982年邝荣禄等[2]首次报道在我国广东发现NIBV。1999年，何长生等[3]从以肾肿大或花斑样肾的呼吸道疾病病例中分离到一株IBV。随后,国内20多个省市相继报道有NIB发生[4]。

1 山东临沂地区禽病流行情况

山东为全国的家禽养殖大省，而临沂是山东省主要的家禽养殖基地，以肉鸡、蛋鸡和水禽为主。据调查统计[5]，目前临沂市禽病主要以新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎为主的病毒病。其中，以传染性支气管炎为例，与往年相比，发病明显减少，肉鸡仅在春天有一定发病比例，蛋鸡在开产前有零星发病情况，但一般不严重，致死率较以前相比，明显下降。

2 材料

2.1 试验动物

2.1.1 发病鸡只 山东临沂地区4处鸡场40日龄自然发病、临床上疑似肾型鸡传染性支气管炎病死鸡 120 只， 编号 A1-A30、B1-B30、C1-C30、D1-D30。

2.1.2 SPF鸡胚 试验用 9～12日龄的 SPF鸡胚200枚，购自山东省某家禽研究所。

2.2 试验主要仪器及药品

2.2.1 试验仪器 电泳仪：无锡久平仪器有限公司，型号JY-SP12；紫外灯仪：南京顺泰科技有限公司；基因扩增仪：龙口市先科仪器公司，型号MG；单人净化操作台：苏州净化设备有限公司生产，型号为SW-CJ-1FD；37℃恒温箱：龙口市电路制造厂生产，型号为YY0027-90；台式离心机：常州市凯航仪器有限公司,型号KA-1000；孵化机：北京方通孵化机公司，型号FT-XFC3。

2.2.2 试验药品 胰蛋白酶：购自上海快灵生物科技有限公司，工作浓度为1.47%；鸡红细胞：采自江苏某孵化场正常鸡，工作浓度为0.9%；青霉素和链霉素：购自鲁南制药集团股份有限公司，工作浓度为950IU；动物疫病基因芯片诊断试剂盒：购自济南百博生物技术股份有限公司。

3 方法

3.1 临床诊断与剖检 观察发病鸡临床症状，记录典型症状。

3.2 病料采集处理 取病死鸡A组气管渗出物、病死鸡B组肺组织、病死鸡C组肾组织、病死鸡D组血液，置于匀浆器中（除D组），加少量无菌生理盐水研磨，制成1：4.5的悬液，反复冻融至少3次后，7800r离心35min，取上清液，加青霉素、链霉素各950IU，置 4℃过夜，备用；D组血液在 4℃静置30min后，1500r离心5min，收集血清，-20℃保存备用。

3.3 鸡胚传代 处理液接种5日龄SPF初代鸡胚，编号同发病鸡只，尿囊腔接种，每一个胚胎0.2ml，在37℃孵化箱中孵化19d，孵化过程中每6h照蛋1次，24h内死亡的鸡胚丢弃，死胚尿囊液及时收集，盲传3代，每一代在37℃孵化箱中孵化24h，孵化过程中每6h照蛋1次，24h内死亡的鸡胚丢弃，编号与A、B、C组病鸡一一对应。

3.4 反转录聚合酶链式反应实验

3.4.1 样本要求 取3.2所述病料处理样本。

3.4.2 RNA提取 ①取 被 测 样 品 200μl，加550μl Tirzol裂解液，上下颠倒混匀，冰上静置15min；②加1/5volum氯仿，颠倒混匀，冰上静置15min，4℃，12000r离心 15min；③取上清液 500μl，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min，4℃，12000r离心 15min；④弃上清液，加入75%的冷乙醇 1ml，14℃，12000r离心 5min，弃上清液，室温静置3min；⑤加入30μl ddH2O溶解沉淀，所得产物即为RNA溶解液。

3.4.3 反转录 采用20μl体系。

简单离心混匀，置于42℃环境内孵育30min，产物置于4℃存放待用（若间隔时间较长，-20℃保存）。

3.4.4 聚合酶链式反应 20μl体系。

简单离心混匀，置于PCR仪中。PCR仪循环参数按照以下设置∶

3.4.5 核酸电泳 ①50XTAE电泳液与ddH2O按1∶50的比例配1XTAE电泳液；②琼脂糖与电泳液按1∶100的比例配制1%的琼脂糖胶，倒板前加入7μl核酸染料；③室温静置 20min，待琼脂糖胶凝固， 备用； ④取 PCR产物 8μl与 2μl Loading buffer，吹打混匀加入琼脂糖凝胶孔；⑤样品孔前孔加入 3μl 2000PlusⅡMarker；⑥电泳 20min；⑦电泳好的琼脂凝胶放到紫外灯上观察结果。

4 结果

4.1 临床及剖检观察 发病鸡群表现精神沉郁，下痢，羽毛凌乱，排白色石灰样粪便，发病率65%，死亡率约7.5%。剖检主要病理变化表现为肾肿大、颜色苍白，呈菜花状，切面呈“花斑”状（图1），肾小管内充满尿酸盐结晶；气管环轻微出血，气囊浑浊变厚；输尿管扩张，内有白色柱状尿酸盐；泄殖腔内有大量乳状尿酸盐沉积，肝、肺、腔上囊和腺胃乳头均正常。部分病、死鸡可见气管环出血,但无明显粘液栓存在。

图1 剖检病死鸡

4.2 鸡胚传代 病料处理液接种SPF鸡胚后第一代 5d内死亡 5枚；6～11d内死亡 2枚，12～19d内死亡3枚，胚体表面有散在出血点，初代接种鸡胚，少数发育受阻(图2），多数鸡胚存活，符合本病毒特征。第2代接种后6h死亡3枚,7～12h死亡1枚，24h收获1枚活胚，胚体表面有少量出血点。第3代接种后6h收获1枚死亡胚，胚体后脑及背部有点状出血。第4代接种后12h内死亡2枚，24h收获1枚活胚，胚体全身有出血点（图3）。

图3 收获活胚，胚体表面有出血点

4.3 PCR 根据图4凝胶电泳试验结果显示，本试验提取的病毒为IBV阳性，即该病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒。

图4 PCR结果

5 防治

5.1 预防 加强鸡场饲养管理，定期消毒，严格执行隔离、检疫等卫生防疫措施。降低饲养密度，保持适宜温度，减少各种应激，合理配比饲料，防治维生素缺乏。

目前该病的预防疫苗主要有M41的弱毒苗，如H120、H52及多价灭活疫苗[15]。因为IBV血清型多，各型间几乎无交叉免疫，所以盲目引进肾型IBV疫苗，有可能会起到适得其反的作用，一般认为M41型对其他型病毒有交叉免疫作用，所以必须掌握流行的血清型，选择和使用与当地的血清型一致的疫苗株。H120一般应用于雏鸡，因其毒力相对较弱，对雏鸡更为安全；H52毒力较强，一般应用于20日龄以上鸡。在饲喂管理上，用玉米粉代替蛋白质饲料以减轻肾脏的负担，同时，小苏打或电解质饮水，2～3d后症状有所缓解。必要的时候也可以在饲料中添加主治该病的中药，如黄芪、党参、金银花、连翘等。

为防止加重肾脏负担，使死亡数量增加[6]应避免使用有肾毒性的抗生素。提取病鸡的病料分离病毒并用分离鉴定过的毒株做成自家苗在开产前和雏鸡阶段进行免疫，能有效的预防感染IBV。

5.2 治疗 对病鸡主要是对症治疗和防止继发感染，可使用广谱抗生素如0.01%强力霉素或0.005%恩诺沙星饮水等，对肾型IBV除防止继发感染外，可在饮水中加入水溶性多维素以及乌洛托品或含有柠檬酸盐的复方药物等，以保肾、补液，促进尿酸盐排出。对于严重病例，采取紧急措施，必要时应及时淘汰。

6 总结和讨论

根据实验中所观察的剖检结果及通过各项鉴定数据方法所得的数据分析，确定分离所得病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒，本实验中的主要病变在肾脏和呼吸道。肾病变型支气管炎除呼吸器官病变外，可见肾肿大，肾小管内尿酸盐沉积而扩张，肾呈花斑状，输尿管尿酸盐沉积而变粗；心、肝和脾脏表面也有沉积的尿酸盐似一层白霜；有时可见法氏囊有炎症和出血症状；病鸡排白色稀粪。但本病临床诊断意义不大，应注意同中毒性疾病、减蛋综合征等其它疾病区分。

实验表明，肾型IBV呼吸道症状明显，潜伏期约1～7d。然后鸡出现了严重的腹泻，甚至死亡，病程约21d。调查过程中发现，在肾型IBV流行特点主要是发生在2～6周龄以内的雏鸡，20%～45%的死亡率，呼吸道症状呈一过性。

本病目前还无特效疗法的报道，因此，应重视早期临床症状观察和流行病学调查，结合解剖特征、分子生物学诊断，对疾病进行早期控制；当出现有疑似患病鸡群时，应及时采取治疗措施，必要时进行捕杀，防止病原扩散，将危害程度最小化。