纯合o2o2背景下玉米胚乳硬质度与赖氨酸含量的遗传研究

齐建双，谷利敏，夏来坤

(河南省农业科学院 粮食作物研究所，河南 郑州 450002)

优质蛋白质玉米(QPM)中富含赖氨酸和色氨酸，其生物效应和营养价值比普通玉米高。我国自20世纪70年代初开始研究优质蛋白质玉米，先后培育出了一大批的优质蛋白质玉米品种，但这些品种均未得到大面积推广种植，原因是这些品种多多少少都存在一定的缺陷。总体来说，我国早期育成的高赖氨酸玉米品种的赖氨酸含量达标，但胚乳硬质度不达标，由于籽粒容重下降，这类品种产量比普通玉米低10%左右；近期育成的优质蛋白质玉米品种有的是胚乳硬度达标，赖氨酸含量稍低，也有少部分品种是赖氨酸和胚乳硬度都达标，但种植范围有限制，在夏季高温多雨的地区因易感穗腐病而无法种植。由此可见，优质蛋白质玉米在o2o2纯合背景下表现出来的籽粒容重低、粉质不透明、易感穗腐病等不良性状一直是影响其大面积推广种植的一个瓶颈问题。为解决这一难题，国内外研究人员进行了大量研究。1969年，Paez等[1]首先发现o2胚乳修饰基因Opm，将Opm导入o2突变体后选育出高赖氨酸的QPM，其籽粒赖氨酸含量达到 0.40%以上，同时胚乳硬质度也大大提高。但由于Opm包含多个遗传位点，导致Opm的修饰效应不同，不同遗传背景(也有的认为是不同粒型)的材料含有o2修饰基因的数量不同，改良效果也不尽相同[2-4]。石德权等[5]、杨引福等[6]、宋同明等[7]从修饰基因的利用实践中指出，修饰基因的频率决定o2玉米胚乳透明度，增加胚乳硬质度，虽籽粒物理性状得到改良，但赖氨酸含量有下降趋势。2010年，据美国物理学家组织网(http：//phys.org)报道，美国研究人员发现，γ醇溶蛋白(γ-zein)会使玉米籽粒更加坚硬。2016年Liu等[8]研究发现，优质蛋白质玉米胚乳发育过程中，27 ku γ-zein的转录和蛋白质表达水平是野生型和o2突变体的 2～3倍，RNAi沉默后优质蛋白质玉米籽粒重新由硬质变为软质，同时证明了27 ku γ-zein的调控因子(qγ27)为顺式调控元件，属于基因剂量效应调控。27 ku γ-zein 基因所在的QTL是调控修饰o2胚乳最重要的位点之一[9]。也有研究想直接避开胚乳硬质度和赖氨酸含量的矛盾，如高树仁[10]认为，以普通玉米与o2玉米自交系组配杂交种是一种值得探讨的高赖氨酸玉米选育方法。关于这个问题的研究还有很多，这些研究总结起来一致认为，赖氨酸含量与胚乳的硬质程度呈负相关，这是一对事实存在的矛盾。但对在o2o2纯合背景下赖氨酸含量与胚乳硬质度表达的研究还相对比较薄弱。鉴于此，选用遗传背景清晰、育种上广泛应用的几个材料及其组合进行研究，揭示纯合o2o2背景下玉米胚乳硬质度与赖氨酸含量的遗传规律，为优质蛋白质玉米育种提供一定的借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料

普通玉米骨干自交系郑58、昌7-2和掖478以及由它们作为轮回亲本回交转育成的高赖氨酸近等基因系QZ58、QC72、Q478家系各10个；高赖氨酸供体自交系齐205、CA042；由齐205、QZ58、QC72和Q478根据杂种优势模式组配的组合4套，分别为QZ58×齐205、QZ58×QC72、QC72×QZ58和Q478×QC72。

1.2 方法

1.2.1 田间试验 杂交组合组配：选长势一致的父本穗行混合取粉，与对应的母本杂交，收获时按行收获考种，测量籽粒容重。F2代试验：按收获的穗行种植，每个组合各种植10个穗行。采用与大田普通玉米错期播种的试验方案，完全随机设计，4行区，3次重复。行长4 m，行距0.6 m，株距0.25 m。每个杂交组合在边行套袋自交6穗以备检测籽粒赖氨酸含量，收获时每小区取中间2行从第4株开始连续收获10穗，进行测产并测量籽粒容重。

1.2.2 分子标记鉴定 SSR标记选用齐建双[4]已建立的MAS技术体系的o2基因内标记umc1066。

1.2.3 容重测定 按照GB/T 5498—2013测定。

1.2.4 赖氨酸含量测定 用MATRIX-I近红外光谱分析仪采用籽粒无破损法测定。将收获的F2代自交籽粒按照不同的杂交组合进行混合，每个杂交组合取3份，每份混匀测量3次，求其平均值。

1.3 数据处理

采用Excel和SPSS软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记基因型鉴定

回交转育的近等基因系基因型检测以QC72家系为例(图1)。回交转育成的QC72家系在o2位点纯合。同样，QZ58和Q478家系在o2位点也都达到隐性纯合。

2.2 杂交一代(F1)玉米胚乳硬质度表现

隐形突变基因(例如sh2和wx)在接受了普通玉米的花粉后，会产生花粉直感使杂交后代籽粒变成普通玉米。同样，o2o2基因纯合材料在接受了普通玉米的花粉后，也会产生花粉直感使F1代种子表现为硬质程度很高的普通玉米籽粒。但双亲均为o2o2基因纯合且胚乳硬质程度差别较大的2个自交系杂交，F1代种子胚乳硬质度表现尚不明确。

在以往的研究[2-4]中已经得知，o2o2基因纯合试验材料中QC72家系的胚乳硬质度比QZ58家系高得多。根据试验结果(图2)发现，在o2o2背景下，2个近等基因系正反交得到的杂交F1代种子胚乳硬质度存在较大差异：以胚乳硬质度高的QC72家系作父本时，F1代籽粒的硬质程度较低，与其母本QZ58家系接近；反过来，而以胚乳硬质度高的QC72家系作母本时，F1代的籽粒胚乳硬质度较高，与其母本QC72家系接近。这说明在o2o2基因纯合背景下，F1代种子胚乳硬质度具有母本效应，没有花粉直感效应。这与Pixley[11]、杨引福等[12]、齐建双等[13]的结论吻合。

P1：普通玉米自交系昌7-2； P2：高赖氨酸供体亲本CA042； 95—102：QC72家系中的8个单株图1 普通昌7-2及QC72家系SSR检测结果

图2 o2o2基因纯合的QC72与QZ58家系正反交示意

2.3 不同杂种优势类群杂交组合F2代玉米籽粒容重、赖氨酸含量的方差分析

由表1、2可以看出，4个不同杂种优势类群杂交组合的重复之间容重和赖氨酸含量差异均不显著。说明在o2o2基因纯合背景下，杂交组合的籽粒胚乳硬质度和赖氨酸含量受小环境影响不大，所以杂交组合之间胚乳硬质度、赖氨酸含量的差异均由基因型差异引起。

表1 不同杂种优势类群杂交组合F2代玉米籽粒容重方差分析

表2 不同杂种优势类群杂交组合F2代玉米籽粒赖氨酸含量方差分析

2.4 不同杂种优势类群杂交组合近等基因系家系内部F2代玉米籽粒容重、产量、赖氨酸含量的方差分析

在4个不同杂交类群杂交组合各10个近等基因系家系内部，对F2代容重、产量和赖氨酸含量分别做方差分析，结果(表3)表明：不同杂交类群杂交组合家系内部的杂交组合之间产量差异均未达到显著水平，赖氨酸含量也只有Q478×QC72达到显著水平。但杂交组合QZ58×齐205、QZ58×QC72、Q478×QC72近等基因系家系内部容重差异均达到极显著水平。也就是说，这4个杂交组合近等基因系家系内部的10个穗行之间籽粒产量和赖氨酸含量差异均较小，只有容重存在较大差异。因此，在赖氨酸含量没有显著差异的QZ58×齐205、QZ58×QC72、QC72×QZ58中可以找到胚乳硬质度较高的近等基因系家系杂交组合，解决赖氨酸含量与胚乳硬质度的矛盾。

表3 不同杂种优势类群杂交组合近等基因系家系内部F2代玉米容重、产量和赖氨酸含量的方差分析

注：*表示在5%水平显著，**表示在1%水平极显著，下同。

2.5 F2代籽粒赖氨酸含量与F1容重、F2容重之间的关系

对F1容重、F2容重与F2赖氨酸含量三者做相关分析，结果(表4)表明：F2代籽粒赖氨酸含量与F1容重、F2容重均呈负相关，但与F2容重未达到显著水平，仅与F1容重达到了显著水平，但决定系数(R2=10.24%)不大；F1容重与F2容重呈正相关，未达到显著水平。由此可见，F2容重与F2赖氨酸含量之间没有直接的决定关系，赖氨酸含量与胚乳硬质度的关系并不十分密切。

表4 F1容重、F2容重与F2赖氨酸含量之间的相关性分析

2.6 不同杂种优势类群杂交组合F1容重、F2容重与F2赖氨酸含量平均值多重比较

从表5可见，4个不同杂种优势类群杂交组合F1容重平均值表现为QC72×QZ58组合极显著高于QZ58×齐205、QZ58×QC72、Q478×QC72组合，QZ58×QC72、Q478×QC72组合显著高于QZ58×齐205组合。F2容重平均值表现为Q478×QC72组合显著高于QZ58×齐205、QZ58×QC72组合，极显著高于QC72×QZ58组合。F2赖氨酸含量平均值表现为Q478×QC72组合显著高于QC72×QZ58组合，极显著高于QZ58×QC72组合，与QZ58×齐205组合差异不显著。其中，杂交组合QZ58×QC72与QC72×QZ58是胚乳硬质度有较大区别的2个亲本的正反交组合，其F1容重存在极显著差异，但F2代容重与F2代赖氨酸含量差异均未达到显著水平。杂交组合Q478×QC72 F2代容重在4个类群杂交组合中最大，赖氨酸含量也最高，表明o2o2基因纯合背景下杂交组合的容重和赖氨酸含量可以达到完美结合。

表5 不同杂种优势类群杂交组合的F1容重、F2容重与F2赖氨酸含量

注：同列不同大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上差异极显著、显著。

3 结论与讨论

玉米籽粒是玉米的主要储藏器官，是玉米产量的直接决定因素，胚乳是主要的储藏物积累场所[14]，胚乳的质量直接决定着玉米的品质。普通玉米的胚乳蛋白质中有70%赖氨酸含量很低的醇溶蛋白，o2突变体能够降低这类醇溶蛋白的合成，同时显著增加非醇溶蛋白的含量，从而极大地提高籽粒中赖氨酸和色氨酸的含量[15-16]，进而改善玉米胚乳的品质。而玉米胚乳的硬质度决定着玉米的储藏品质。因此，选育出赖氨酸含量高、胚乳硬质度较高的优质蛋白质玉米新品种才能满足市场的需要。本研究结果表明，在纯合o2o2背景下，F2代籽粒赖氨酸含量与F2代籽粒容重呈不显著负相关，证明玉米籽粒胚乳硬质程度与赖氨酸含量这对矛盾是可以化解的，这与胚乳修饰基因可以改变玉米籽粒胚乳硬质度而赖氨酸含量不明显降低的结论是一致的。因此，在育种的过程中，应该选择合适的遗传材料(如硬粒型材料，在回交转育的近等基因系后代中会出现从软质到硬质的一系列胚乳变异[2])，同时注意胚乳修饰微效基因的频率积累。

胚乳修饰基因自1969年被发现以来已有近50 a 的研究历程，但研究进展较慢且大部分研究集中在国外[17]，利用效率也较低。在我国，优质蛋白质玉米的主要研究方法还是通过分子标记辅助选择和常规育种技术相结合对普通玉米核心自交系进行回交转育[3，18-19]，这种方法的局限性在于，在回交转育的过程中不仅将高赖氨酸基因转进了普通玉米自交系，同时部分不利基因也会转育进去，导致回交转育成的高赖氨酸近等基因系的配合力下降，利用效率降低。随着转基因等现代生物技术的发展，利用更先进的方式快速发掘胚乳修饰基因，将高赖氨酸基因和胚乳修饰基因同时转入普通玉米自交系，将是未来优质蛋白质玉米育种的主要方向。