竹炭与有机肥配施对烟草二甲四氯药害的修复效应

杨 森，黄化刚，龙友华，陈 雪，李 磊，代园凤，尹显慧*

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省烟草公司 毕节市公司，贵州 毕节 551700)

烟草(Nicotianatabacum)是我国重要的叶用经济作物之一，对除草剂较为敏感。研究调查发现，为防除烟地杂草，前茬作物过量使用除草剂致后茬烟草药害的情况时有发生[1]，且有不断上升的趋势，给烟叶安全生产带来较大的影响。二甲四氯为选择性内吸传导激素型苯氧乙酸类除草剂，主要用于小麦和玉米等田间阔叶杂草的防除[2-3]，且因其除草效果显著，价格低廉，在烟田被大规模使用[4-5]。近年来，贵州毕节地区烤烟—玉米和烤烟—高粱是主要的农业生产模式，由于部分烟农盲目追求除草效果等原因造成了二甲四氯过量使用，使得前茬作物上使用的二甲四氯残留在土壤中，严重影响了后茬烟叶的品质和产量[6]。因此，如何预防和缓解二甲四氯除草剂药害，降低烟农损失已成为烤烟生产上亟待解决的问题。

生物炭是指由含碳量丰富的生物质在较低温度、缺氧或限氧条件下，经过高温慢热解而得到的一种细粒度、多孔性碳质材料[7]。目前，较多研究表明，生物炭吸附力强[8]，可调控土壤中微生物数量及其群落结构组成[9]，还可提高土壤肥力[10]并增加营养物质持有量[11]，增碳减排效果显著，从而促进作物生长。因此，生物炭被广泛应用于重金属[12]和除草剂[13-14]等污染土壤的改良和修复。陈懿等[15]通过田间试验研究发现，土壤中施入烟秆炭可提高土壤肥力及烟株根系体积、干质量，促进烤烟生长。丁春霞[16]研究证明，生物炭对二氯喹啉酸具有良好的吸附性能，可缓解其对烟草的药害。李新安等[17]研究表明，4 g/kg生物炭对咪唑乙烟酸致害花生的叶绿素、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等指标均具有一定的改善效果。此外，有机肥也能改善土壤微生物环境，降低无机和有机污染物生态风险，进而改良土壤理化性状，提高土壤肥力，故常被作为污染土壤修复材料[18-21]。然而，目前竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟草的修复效应及其机制尚未见报道。为此，通过盆栽试验研究二甲四氯致烟草药害症状及其临界值，再通过竹炭和有机肥配施对致害烟株进行修复，了解修复效果并探究其修复机制，以期明确竹炭用量，探索二甲四氯除草剂致烟草药害的有效修复方法，为烟草产业的可持续健康发展提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试烟草为贵烟1号，由黔西县林泉科技园惠赠。漂浮育苗至3～4叶期，移出温室，置于遮阴处并常规管理，3 d后移栽至花盆中。盆栽土壤取自贵阳市花溪区前茬为荒地的土壤，颜色为偏黄色，土壤放置铺平暴晒3个月，经高效液相色谱法检测无二甲四氯残留后使用。供试土壤理化性质经国家标准方法测定后，全氮为1.32 g/kg，全磷为0.94 g/kg，全钾为17.60 g/kg，碱解氮为105.24 mg/kg，有效磷为16.26 mg/kg，速效钾为143.22 mg/kg，缓效钾为326.33 mg/kg，有机质为30.73 g/kg，pH值为6.69。供试除草剂为56%二甲四氯可溶粉剂，由山东胜邦绿野化学有限公司提供。竹炭由贵州省毕节市烟草公司西河烟草科技园提供；有机肥由贵州吉龙生态科技有限公司提供，有机质含量为70.63%，全氮为3.95%，全磷为1%，有机炭为21.32%，全钾为1.9%。

1.2 试验设计

1.2.1 二甲四氯土壤残留致烟草药害症状及其致害临界值的观测 二甲四氯最高施药剂量参考其田间最大施用量及我国农田20 cm耕作层每公顷2.25×103t干土进行换算[22]。二甲四氯设置4个剂量处理，称取10 kg土壤，用喷雾法分别添加5 g/L二甲四氯母液1、2、4、20 mL，统一加入适量水缓慢均匀浇透各供试土壤，混合均匀，土壤中二甲四氯有效成分含量分别为630、1 260(常规推荐用量)、2 520、12 600 g/hm2，分装在5个花盆(高×宽=11 cm×9 cm)中，即5次重复，另设清水对照(CK，即不施二甲四氯)。施药3 d后，每盆移栽1株长势基本一致且健壮的3叶期烟苗，室外常规水肥管理。观察烟株药害症状，60 d后利用株高、叶长及叶宽抑制率10%～15%作为烟草致害临界值的参考标准[22]，其中以株高和叶长抑制率为主要参考值。

1.2.2 竹炭和有机肥配施对二甲四氯土壤残留致烟草药害的修复效应 试验于2015年3—9月在贵州大学南校区农药厂试验基地进行。采用喷雾法，按照二甲四氯田间常规推荐用量10倍配药，与10 kg土壤混合均匀后装盆(高×宽=35 cm×40 cm)，即土壤中二甲四氯有效成分含量为12 600 g/hm2。1 d后，往施药花盆中添加修复剂，混合均匀，并向花盆加入1 g烟草专用肥。试验设7个处理，CK：清水对照(即正常烟株)；CK1：药剂对照，即花盆中添加二甲四氯，不加修复剂；CK2：有机肥50 g；T1：有机肥50 g+竹炭30 g；T2：有机肥50 g+竹炭60 g；T3：有机肥50 g+竹炭120 g；T4：有机肥50 g+竹炭240 g。每个处理10次重复。加入修复剂2 d后每盆移栽1株长势基本一致的3叶期健壮烟苗，其他水肥管理等按当地优质烟叶生产技术规范进行。于烟苗移栽30、80 d后观察其药害症状，测量株高、叶长和叶宽(自上到下第4片叶)，并计算相应抑制率。80 d后将烟株拔起，观察其根系生长情况，测定主根长度，并拍照记录。

1.3 测量指标及方法

1.3.1 烟叶生理生化指标和化学成分测定 烟苗移栽30、60、80 d后取烟株从上到下第4片有效叶，分别测定烟叶SOD、POD活性和MDA含量。烟苗移栽80 d后，取烟株自上而下第4片叶，120 ℃杀青后，测定烟叶总糖、还原糖、烟碱、总氮和钾含量。其中，抗氧化酶液提取参照Moerschbacher等[23]的方法；SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[24]测定，以抑制NBT光化还原50%为1个酶活力单位(U)；POD活性采用Kochba等[25]的方法测定，以OD470增加1为1个酶活力单位；MDA含量参考张志良等[26]的硫代巴比妥酸方法，改进后进行测定，以μmol/g表示；化学成分采用王瑞新[27]的方法测定。

1.3.2 烟叶透射电镜样品制备与观察 2015年9月，选取盆栽试验烤烟从上至下第4～5片叶中部靠近主叶脉的叶肉组织，用手术刀将其剪切成长和宽为1 cm的组织块，放入预先配制好的2.5%戊二醛固定液(pH值为7.3～7.4)中固定，4 ℃冰箱内固定1 d后，再用PBS清洗2～3次，继续用1%锇酸固定1 h左右。梯度脱水(50%、70%、80%、90%乙醇各15 min，最后用100%丙酮在室温条件下处理3次，每次10 min)，梯度渗透液渗透后，Epon 812进行渗透包埋，Leica ultracut R(德国莱卡)超薄切片机切片，用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色法对切片染色，JEM1230型(日本JEOL公司)透射电子显微镜观察、拍照。

1.3.3 烟叶及土壤中二甲四氯残留检测 参照傅强等[28]、单淑芳[29]和刘金胜等[30]的土壤和植株二甲四氯残留测定方法并改进。采用Waters 600E液相色谱仪紫外检测器检测，检测条件为：Agilent 300SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为V(甲醇)∶V(1%乙酸水)=70∶30的混合溶液；流速1 mL/min；检测波长230 nm；柱温27 ℃；进样量10 μL。以保留时间定性，峰面积外标法定量，在上述色谱条件下，二甲四氯的保留时间为6.708 min。

1.4 数据分析

采用Excel 2010对试验数据进行整理，用SAS统计软件对数据进行单因子方差分析，Duncan’s方法检验不同处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 二甲四氯土壤残留致烟株药害症状及其致害临界值

二甲四氯土壤残留对烟草生长有较大影响，随其残留量的增加，药害症状越加明显。二甲四氯致害烟株药害症状主要表现为烟叶黄化和短小、烟株矮小、烟株生长缓慢或停滞、高剂量下烟株停止生长或死亡(图1)。烟苗移栽9 d后，开始出现二甲四氯药害症状，40 d后烟株药害症状更明显，可见二甲四氯除草剂致烟株药害症状不易恢复。

图1 不同剂量二甲四氯处理对烟株生长的影响(移栽后40 d)

二甲四氯土壤残留对烟株农艺性状有较大的影响(表1)，其株高、叶长和叶宽抑制率随施药剂量的增加而增加。烟苗移栽60 d后，土壤二甲四氯剂量为630 g/hm2时，烟株株高、叶长和叶宽抑制率分别为-28.30%、-10.13%和2.41%，说明烟株生长基本不受抑制，反而有促进作用。当土壤二甲四氯剂量由1 260 g/hm2增加到2 520 g/hm2时，烟株株高、叶长和叶宽的抑制率分别从-18.87%、-3.55%和4.81%升高为3.30%、0.53%和11.11%。土壤二甲四氯剂量为12 600 g/hm2时，烟株株高、叶长和叶宽的抑制率最大，分别为15.09%、21.25%和15.93%，除叶宽外，其他农艺指标与常规推荐用量(1 260 g/hm2)处理差异显著。因此，二甲四氯土壤残留致烟草药害临界值介于2 520～12 600 g/hm2。

表1 二甲四氯土壤残留对烟株农艺性状的影响(移栽后60 d)

注：同列不同小写字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05)，不同大写字母表示差异达极显著水平(P<0.01)，下同。

2.2 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟株生长的影响

2.2.1 农艺性状 由表2可知，竹炭和有机肥配施对二甲四氯土壤残留致害烟草有较好的修复效果。药剂对照CK1处理中，烟苗移栽30 d和80 d后，致害烟株药害症状明显，两时期烟株株高、叶长、叶宽抑制率分别为42.97%和14.40%、50.95%和23.46%、57.82%和25.73%，可见烟株生长遭到明显抑制。烟苗移栽30 d后，各修复处理对二甲四氯致害烟株都有较好的修复效果，其中以T2对致害烟株株高的修复效果最好，株高抑制率为-56.14%，T1次之，抑制率为-45.10%，两处理差异不显著。同时以T1对致害烟株叶长和叶宽的修复效果最佳，其抑制率分别为-8.11%和-24.70%，T2次之，抑制率分别为-2.55%和-22.42%，且两处理差异不显著。烟苗移栽80 d后，加入修复剂处理烟株株高和叶长不受抑制，其中T2处理对二甲四氯土壤残留致害烟株的修复效果最好，株高、叶长和叶宽的抑制率分别为-24.41%、-13.98%和-9.92%。

表2 不同用量竹炭和有机肥配施对不同时期二甲四氯致害烟株农艺性状的影响

2.2.2 烟株根系 从图2可以看出，竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟株根系有较好的修复作用。各处理中，药剂对照CK1处理致害烟株主根长最短，仅为14.17 cm，同时此处理烟株根量也较少，可见，二甲四氯土壤残留严重影响烟株根系正常生长。各修复处理对烟株根系都有一定的修复效果，其中以T2处理对致害烟株主根长的修复效果最好，其主根长为19.83 cm，较CK1提高了39.94%(图2a)。然而，T3和T4处理对致害烟株根量的修复效果最佳，从图2b可看出，这2个处理致害烟株根量比药剂对照CK1和清水对照CK都多，说明竹炭和有机肥配施有利于二甲四氯致害烟株根系的生长发育。

a.各处理主根长；b.根系修复效果。不同小写字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05)图2 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟株根系的影响(移栽后80 d)

2.3 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟叶生理生化指标的影响

2.3.1 POD活性 如图3所示，二甲四氯土壤残留可降低致害烟叶POD活性。加入竹炭和有机肥修复剂后，可提高二甲四氯致害烟叶POD活性，不同时期烟叶POD活性呈先增加后下降的趋势。烟苗移栽60 d后，各处理烟叶POD活性达到一个峰值，其中各修复处理(CK2、T1、T2、T3、T4)POD活性分别为438.61、700.78、947.52、725.33、737.89 U/(g·min)，分别比药剂对照CK1提高了29.96%、107.64%、180.75%、114.92%、118.64%，除CK2处理外，其他修复处理与CK1差异显著，其中以T2处理POD活性最高，并与清水对照差异不显著。

同一时期标注小写字母不同表示处理间差异显著(P<0.05)，下同图3 不同用量竹炭和有机肥配施对不同时期二甲四氯致害烟叶POD保护酶活性的影响

2.3.2 SOD活性 如图4所示，二甲四氯土壤残留严重影响烟叶SOD活性，不同时期(30、60、80 d)药剂对照CK1烟叶SOD活性分别为411.25、550.21、523.28 U/(g·h)，较清水对照CK降低了31.24%、30.45%、28.28%。各处理以60 d后烟叶SOD活性最高，其中修复处理T2的SOD活性为727.51 U/(g·h)，较CK1提高了32.33%，差异显著。

图4 不同用量竹炭和有机肥配施对不同时期二甲四氯致害烟叶SOD保护酶活性的影响

2.3.3 MDA含量 二甲四氯土壤残留可导致致害烟叶MDA含量升高，并随时间的延长进一步升高，烟苗移栽80 d后达到峰值，含量为11.37 μmol/g(图5)，可见二甲四氯致害烟叶随时间的延长受害程度加重。加入竹炭和有机肥混合修复剂后，不同时期致害烟叶MDA含量都低于药剂对照CK1，80 d 后，各修复处理(CK2、T1、T2、T3、T4)烟叶MDA含量为7.41、6.79、6.44、7.23、7.07 μmol/g，较CK1分别下降了34.82%、40.28%、43.35%、36.41%、37.81%，且差异显著，但各修复处理间差异不显著。

图5 不同用量竹炭和有机肥配施对不同时期二甲四氯致害烟叶MDA含量的影响

2.4 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟叶细胞超微结构的影响

从图6可以看出，清水对照CK烟叶叶绿体呈梭形，所含淀粉粒大小适中，基粒和基质片层清晰，叶绿体紧贴细胞壁排列，细胞结构较完整。与CK相比较，二甲四氯土壤残留量为12 600 g/hm2(CK1)的致害烟株烟叶细胞结构有明显的变化，其叶绿体偏离细胞壁一定距离，出现质壁分离现象，叶绿体和线粒体中部边缘有凹陷，且形状有所变化，基质和基粒排列不清晰，嗜锇颗粒增多，淀粉粒体积变小；而修复处理T2中，烟叶叶绿体紧靠细胞壁排列，未出现质壁分离现象，线粒体呈规则的椭圆形，基质和基粒片层逐渐清晰，淀粉粒增多且体积较大，细胞发育逐渐恢复稳定。

2.5 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟叶化学成分的影响

如表3所示，二甲四氯土壤残留致害烟叶总氮、钾、总糖、还原糖含量为1.32%、1.35%、12.63%、13.13%，与清水对照CK相比分别下降了24.57%、23.72%、32.81%%、27.69%，而烟碱含量为2.59%，较CK提高了60.02%。此外，致害烟叶的糖碱比和氮碱比分别为5.15和0.51，与CK比较，分别下降了55.94%和54.86%，可见二甲四氯土壤残留严重影响烟叶品质。然而，加入竹炭和有加肥混合修复剂后，不同处理致害烟叶化学成分含量都趋于CK，逐渐恢复到正常水平。其中以T2处理修复效果最佳，其烟叶的总氮、钾、总糖、还原糖、烟碱、糖碱比、氮碱比分别为1.59%、1.65%、16.72%、16.23%、1.74%、9.36、0.92，除烟碱外，其他各化学成分含量和比值介于致害烟叶和CK之间，其中钾、还原糖和烟碱含量与CK差异不显著。可见，竹炭与有机肥配施对二甲四氯致害烟叶化学成分有较好的修复作用。

M.线粒体；Ch.叶绿体；S.淀粉粒；GL.基粒片层；SL.基质片层；P.嗜锇颗粒；CW.细胞壁图6 竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟叶细胞超微结构的影响

表3 不同用量竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟叶化学成分的影响

2.6 植烟土壤和烟叶中二甲四氯的残留量

二甲四氯的残留检测结果表明(表4)，在正常烟株土壤及烟叶中均未检测到二甲四氯，说明该试验土壤前茬作物未使用二甲四氯或使用量较少致检测不到。烟苗移栽后30 d，药剂对照CK1土壤和烟叶中二甲四氯的含量较高，分别为1.671 3 mg/kg和0.085 0 mg/kg，高于我国规定的稻米中二甲四氯最大残留限量0.05 mg/kg[29]。然而，在二甲四氯残留土壤中施用竹炭60 g和有机肥50 g(T2)，烟苗移栽后30 d土壤和烟叶中二甲四氯的残留量分别为0.512 3 mg/kg和0.022 5 mg/kg，较CK1减少了69.34%和73.52%，烟苗移栽后80 d此处理土壤和烟叶中均检测不到二甲四氯，而CK1土壤和烟叶二甲四氯残留量分别为0.541 9 mg/kg和0.032 6 mg/kg，说明修复处理T2能有效加快植烟土壤和烟叶中二甲四氯残留的降解。

表4 土壤和烟叶中二甲四氯残留量 mg/kg

注：ND表示未检出。

3 结论与讨论

近年来，长残效除草剂土壤残留致后茬烟草药害问题日益突出。二甲四氯为激素型内吸性除草剂，广泛应用于稻、麦和玉米等禾本科作物，防除1年生和多年生阔叶杂草[31]。但由于二甲四氯除草剂使用量的增加，在土壤中残留时间较长[32]，易对后茬作物产生药害[33-34]。明确二甲四氯除草剂致烟草药害症状和临界值及探索其修复技术，对二甲四氯致烟草药害的预防和修复将起到关键作用。

本试验结果表明，二甲四氯致烟草药害症状为植株矮小、烟叶黄化且短小，低剂量可促进烟株生长，但高剂量下烟株死亡或停止生长。并且，初步明确了二甲四氯致烟草药害的临界值介于2 520～12 600 g/hm2，故后茬烟草种植时可检测烟地二甲四氯残留量，评估除草剂土壤残留致后茬烟草产生药害的风险，以防除草剂药害产生。

目前，除草剂污染土壤的改良措施主要有化学、物理和生物技术[35]。生物技术对环境友好、无污染，是当下治理除草剂污染问题较流行的方法。同时生物炭可改善微生物生存环境，对植烟土壤生物学特性有较好的改良作用[36]，对土壤肥力也有优越的改良效果[37-39]，因而被广泛应用在农业生产中。郑雄志等[40]通过盆栽试验研究发现，施用1 875 kg/hm2生物质炭，对土壤残留常规用量3倍二氯喹啉酸致烟草药害的修复效果最佳，建议后茬烟地施用生物质炭1 500 kg/hm2，能够有效预防和缓解烟株二氯喹啉酸药害症状。本研究修复试验结果表明，每株烟苗施用有机肥50 g和竹炭60 g对二甲四氯土壤残留致害烟株农艺性状具有较好的修复效果，可促进致害烟株根系的生长，基本解除除草剂药害症状，恢复到正常生长水平，研究结果与陈泽鹏等[41]研究发现的93.75 kg/hm2活性炭对二氯喹啉酸致害烟株具有较好的缓解效果相类似。

植物在逆境条件下或衰老过程中，细胞内会产生大量的自由基，从而加剧膜脂过氧化程度、损伤生物膜系统，严重时会导致细胞死亡[42]。邓建朝等[43]研究表明，POD在清除二氯喹啉酸致烟草药害的自由基中起到关键作用。本研究结果表明，每株烟苗施用有机肥50 g和竹炭60 g可提高二甲四氯致害烟株烟叶的POD和SOD活性，降低MDA含量，与左涛等[44]的研究结果有相同之处。同时，此处理可使致害烟叶的叶绿体形状规则且紧靠细胞壁排列，避免质壁分离现象出现，让基质和基粒片层逐渐清晰，淀粉粒增多且体积增大，细胞发育逐渐恢复稳定。并且对致害烟叶的化学成分具有较好的协调作用，降低了烟碱含量，提高了总氮、钾、还原糖和总糖含量，使烟叶糖碱比(9.36)、氮碱比(0.92)分别处于优质烟叶的范围(8～12、1或略小于1)[45]，结果与赵殿峰[46]研究结论相吻合。

此外，烟苗移栽30 d后，有机肥50 g和竹炭60 g配施修复处理与药剂对照相比，烟叶和土壤二甲四氯残留量大幅度下降，至80 d时，此修复处理土壤和烟叶中都检测不到二甲四氯残留量。综合来看，有机肥和竹炭配施一方面可有效加快土壤中二甲四氯的降解速率，另一方面可通过生理生化机制来诱导致害烟株提高抗逆性，降低膜脂过氧化程度，促进致害烟叶细胞结构的恢复，增强光合作用和加强生理代谢，使致害烟叶恢复到健康生长水平，从而提高了致害烟叶品质，最终起到修复二甲四氯致害烟株的效应。

总之，每株烟苗施入竹炭60 g和有机肥50 g对二甲四氯污染土壤和致害烟株有良好的修复效果。烟叶生产中，对前茬过量喷施二甲四氯除草剂烟地进行竹炭和有机肥配施，可预防除草剂药害。本研究仅初步探索了二甲四氯致烟草药害症状和临界值及其修复机制，但其具体致害临界值还需进一步测定，竹炭和有机肥配施对二甲四氯致害烟株的分子修复机制也有待研究。