尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定

张永德 林勇 冯鹏霏 陈忠 杜雪松 黄姻 潘传燕 罗洪林

摘要：【目的】制備及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）多克隆抗体，为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础。【方法】采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck，然后转入大肠杆菌B21（DH3）中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后，以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体，并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价。【结果】尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值（GRAVY）为-0.454，属于亲水性蛋白，具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点，无典型的跨膜区。经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD，主要以包涵体形式存在。免疫日本大耳白兔后可获得效价为1∶256000的Lck多克隆抗体，且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白。经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上，纯度约95%，抗体纯化效果良好。【结论】经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性，可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究。

关键词： 尼罗罗非鱼;淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）;原核表达;包涵体;多克隆抗体

中图分类号： S965.125                                   文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2304-07

Preparation and identification of Lck polyclonal

antibody in Nile tilapia

ZHANG Yong-de， LIN Yong， FENG Peng-fei， CHEN Zhong， DU Xue-song，

HUANG Yin， PAN Chuan-yan，  LUO Hong-lin*

（Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and

Healthy Aquaculture， Nanning  530021， China）

Abstract：【Objective】Preparation and identification of Nile tilapia lymphocyte-specific protein tyrosine kinase（Lck） polyclonal antibodies were carried out to lay a foundation for further research on the function and immune mechanism of Lck protein in tilapia. 【Method】The recombinant plasmid pET-B2m-Lck was constructed with seamless cloning technology， and then was transferred into Escherichia coli strain B21（DH3） for expression induction. After purification by Ni-NTA chromatography column， Lck polyclonal antibody was prepared by immunizing Japanese big ear rabbits with purified fusion protein， and the specificity and immunity titer of polyclonal antibody were detected by Western blotting and ELISA. 【Result】The average hydrophilicity（GRAVY） of Nile tilapia Lck protein was -0.454， which was a hydrophilic protein. Lck protein had rich and well-distributed potential epitope site with no typical transmembrane region. The fusion protein obtained by the expression induction of the prokaryotic vector had a molecular weight of about 67.0 kD， and mainly existed in the form of inclusion body. After immunizing Japanese big ear rabbits， a Lck polyclonal antibody with a titer of 1∶256000 was obtained， which could specifically recognize the Lck protein. The concentration of the antibody purified by Protein G affinity chromatography column was above 10 mg/mL， the purity was about 95%， and the antibody was well purified. 【Conclusion】The Lck fusion protein of Nile tilapia obtained by prokaryotic expression induction has good immunogenicity， and the polyclonal antibody obtained after immunity to big ear rabbit has high efficiency and specificity， which can be used in the study of the organism immune mechanism after bacterial infection of tilapia.

Key words：Nile tilapia; lymphocyte-specific protein tyrosine kinase（Lck）; prokaryotic expression; inclusion body; polyclonal antibody

0 引言

【研究意义】淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck）是Src蛋白激酶家族的成员之一，在胸腺细胞发育的各阶段均有表达（邓英辉等，2006）。Lck包含N-端膜锚定区（SH4结构域）、独特的结构域、Src-同源3（SH3）结构域、SH2结构域、催化激酶结构域和C-端尾端（Ngoenkam et al.，2018），在T淋巴细胞抗原受体（TCR）介导的信号转运过程中发挥关键作用。TCR与抗原肽结合可引起Lck与T淋巴细胞共同与CD4+和CD8+相互作用，进而通过激活白细胞介素-2（IL-2）诱导T淋巴细胞增殖和分化（Palacios and Weiss，2004;Salmond et al.，2009;Smith-Garvin et al.，2009），最终引起酪氨酸激酶Zap-70的募集与激活（Kane et al.，2000）。激活的Zap-70分子自磷酸化并为其他信号分子如膜衔接蛋白LAT（用于激活T淋巴细胞的接头）提供停靠位点，后者又募集并激活其他蛋白以启动蛋白激酶C和MAP激酶途径，该途径是T淋巴细胞增殖、分化及其效应功能的基础（Sommers et al.，2004）。罗非鱼是我国重要的水产养殖品种，但近年来链球菌病等细菌性疾病给罗非鱼养殖业带来巨大经济损失，严重阻碍其产业的可持续健康发展（黎小正等，2013;Li et al.，2015;罗伟等，2018）。由于目前对病原入侵罗非鱼后其免疫反应的认识非常有限，且有关Lck在罗非鱼免疫系统中的作用尚不清楚。因此，构建罗非鱼Lck表达载体并进行诱导表达及多克隆抗体制备，对进一步了解Lck的功能乃至鱼类免疫具有重要意义。【前人研究进展】目前已克隆鉴定出Lck基因的硬骨鱼类有日本河豚（Takifugu rubripes）（Brenner et al.，2002）、斑马鱼（Danio rerio）（Langenau et al.，2004）、日本银鲫（Carassius auratus langsdorfii）（Araki et al.，2007）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Chen et al.，2007）、虹鳟鱼（Oncor-hynchus mykiss）（Laing et al.，2007）、大西洋比目鱼（Hippoglossus hippoglossus）（?verg?rd et al.，2010）、鲑鱼（Salmo salar）（Leong et al.，2010）、日本鳗（Anguilla japonica）（Kawabe et al.，2012）、罗非鱼（Oreochromis niloticus）（Gan et al.，2015）和红笛鲷（Lutjanus sanguineus）（Huang et al.，2016）等，但针对硬骨鱼Lck的研究主要集中在基因克隆及其组织表達分布上，虽然有研究显示在T淋巴细胞有丝分裂原（PHA和PMA）的刺激下Lck基因表达增强（Laing et al.，2007），但对Lck在抗细菌侵袭免疫应答中的作用了解非常有限。【本研究切入点】尽管目前已有针对尼罗罗非鱼Lck基因进行克隆与表达分析的研究（Gan et al.，2015），但Lck在罗非鱼免疫反应中的具体作用尚不清楚。【拟解决的关键问题】对尼罗罗非鱼Lck基因进行原核表达，并通过免疫日本大耳白兔制备抗罗非鱼Lck特异性多克隆抗体，以期为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

重组质粒pET-B2m（由pET-28a改造获得）、表达宿主大肠杆菌B21（DH3）购自武汉金开瑞生物工程有限公司，T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白Marker、限制性内切酶BamH I和Sal I购自美国Fermentas公司，IPTG购自德国Merck公司，弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，PVDF膜购自美国Thermo Fisher公司，羊抗兔-HRP抗体购自美国Jackson公司，DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，亲和层析柱料购自美国GE Healthcare公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 蛋白质结构分析及抗原性预测 采用在线分析工具ExPASy中的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测Lck蛋白的亲/疏水性，TMHMM server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对Lck蛋白序列进行跨膜区预测;使用Protean中的Jameson-Wolf方法对Lck蛋白的抗原指数等进行预测分析。

1. 2. 2 目的基因扩增 根据尼罗罗非鱼Lck基因序列（NCBI登录号KM058084），利用Primer Premier 5.0设计PCR扩增引物，上游引物P1：5'-ATGGGTTG

TAATTGCGGTTGTAATTGC-3'，下游引物P2：5'-T

TCTTGATACTGACGTTTCTTGATACTGACGT-3'。以合成的尼罗罗非鱼Lck基因序列为模板进行PCR扩增，扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行28个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测并进行切胶回收。

1. 2. 3 原核表达质粒构建 以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pET-B2m载体，采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck，然后转入大肠杆菌B21（DH3）;筛选阳性克隆，提取质粒后进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果采用DNASTAR MegAlign进行比对分析。

1. 2. 4 目的蛋白小量表达 将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌B21（DH3），取30.0 μL过夜培养菌液接入3.0 mL LB培养基中，37 ℃振荡培养至OD600=0.6。取部分菌液作为对照组，剩余菌液加入IPTG诱导剂至终浓度0.5 mmol/L，对照菌液与诱导菌液继续37 ℃振荡培养3 h;取1.0 mL菌体经12000×g离心30 s，收获沉淀，用100.0 μL的1% SDS进行重悬，混匀。12000×g离心10 min，收集上清液进行SDS-PAGE检测分析。

1. 2. 5 目的蛋白表达与破菌检测 取2.0 mL过夜培养菌液加入到2000.0 mL的LB培养基中，37 ℃振荡培养至OD600约等于0.6;加入IPTG诱导剂至终浓度0.5 mmol/L，30 ℃继续振荡培养3 h。收集发酵液，6000×g离心10 min，收集菌体悬浮于40.0 mL预冷的NTA-0缓冲液中，冰浴超声波破碎细菌，4 ℃下20000×g离心30 min，收集上清液及沉淀。取少量样品进行SDS-PAGE检测分析。

1. 2. 6 包涵体蛋白纯化 将收集的沉淀加入到Ni-NTA树脂层析柱中，收集穿柱液体。以10倍柱床体积的NTA-0、NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500 Buffer进行洗脱，收集各洗脱峰，取少量洗脱液进行SDS-PAGE检测分析。纯度达到要求的组分置于透析袋中，4 ℃下以1×PBS进行透析，最后4 ℃超滤浓缩透析产物。

1. 2. 7 多克隆抗体制备和鉴定 将纯化的融合蛋白与等容积弗氏完全佐剂乳化后，按500 ?g/只的剂量免疫2只日本大耳白兔，皮下多点注射。每只兔子免疫5～6次，每次免疫间隔14 d，并检测免疫效价，待抗体表达恒定后，采血分离血清，-20 ℃保存备用。

1. 2. 8 免疫效价ELISA检测 以Lck融合蛋白为抗原（2 μg/mL），按100 μL/孔加入到96孔板中进行抗原包被，4 ℃过夜;以2%卵清蛋白（OVA）于室温封闭30 min，将待检血清按1∶2000、1∶4000、1∶8000进行二倍梯度稀释至1∶8192000，然后各取100.0 μL加入96孔板，以空白血清为阴性对照。37 ℃温育1 h后，加入HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5000），100.0 ?L/孔，37 ℃温育45 min;洗涤后加入TMB显色液（100.0 μL）显色20 min，以酶标仪测定OD450。阳性反应的最大稀释度即为待测样品效价。

1. 2. 9 Western blotting检测 分别取25和10 ng纯化融合蛋白进行SDS-PAGE检测分析，200 mA湿法转PVDF膜，然后在37 ℃下以封闭液封闭2 h。加入兔抗血清（稀释度体积比1∶1000），37 ℃下摇床孵育1 h。经洗涤后加入羊抗兔-HRP二抗（1∶10000倍体积稀释），37 ℃孵育1 h，取等体积的ECL试剂A液、B液混合滴于PVDF膜正面，于暗室反应2 min，取出胶片立即浸入显影液中显色1 min，浸入定影液中定影1 min，晾干，标定Marker后，拍照分析Lck抗血清的特异性。

1. 2. 10 抗体纯化 采用Protein G亲和层析柱进行抗体纯化。将收集的抗血清与等体积2×PBS混合后上样，用10倍柱体积以上的PBS进行洗涤，至流出液无蛋白检出，加入2倍柱体积的0.1 mol/L柠檬酸（pH 2.7）洗脱，收集洗脱产物，测定OD280估算抗体浓度;以1 mol/L Tris调节洗脱产物pH至中性，采用10 kD超滤管将样品浓缩至所需体积，纯化浓缩后的抗体经稀释后进行SDS-PAGE检测分析，-20 ℃保存备用。

2 结果与分析

2. 1 Lck蛋白亲/疏水性及跨膜区分析结果

Lck基因编码蛋白由501个氨基酸组成，亲/疏水性预测结果显示，Lck蛋白平均疏水性为-0.454，序列中含有较多的亲水性氨基酸，亲水性区段主要为第4～24、26～44、46～54、66～95、99～107、116～132、161～186、197～209、215～248、256～266、248～294、311～319、322～330、348～360、382～397、432～461、469～483和492～501位氨基酸（图1），序列亲水性较强。疏水性氨基酸[丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val）]分别占编码氨基酸的5.19%、2.40%、5.99%、8.38%、3.19%、3.59%和5.39%。跨膜区分析结果显示，Lck蛋白无典型的跨膜区，501个氨基酸均位于细胞膜表面，降低了跨膜区疏水性氨基酸对蛋白折叠的影响，易于表达和纯化。

2. 2 Lck蛋白抗原性分析结果

采用Protean中的Jameson-Wolf方法预测Lck蛋白抗原指数，了解其可能存在的抗原表位位点。由图2可看出，Lck蛋白全長序列中具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点，其中抗原指数较高的区段为第1～14、16～38、44～53、65～92、125～132、146～158、160～173、175～184、203～211、213～228、230～251、256～270、323～331、381～396、429～443、445～462、470～480和492～501位氨基酸。这些位点除抗原指数较高外，多数还具备较强的亲水性，因此采用Lck蛋白制备抗体具有较强的可行性。

2. 3 Lck表达载体的构建及鉴定结果

以pET-B2m-Lck质粒为模板扩增Lck基因，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得一条约1500 bp的目的条带（图3），与预期结果相符。经测序及序列比对分析，确定Lck基因（1503 bp）已正确插入pET-B2m载体中，载体构建成功。

2. 4 目的蛋白小量诱导表达情况

以重组质粒pET-B2m-Lck转化大肠杆菌B21（DH3），经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析，结果如图4所示，在约67.0 kD处出现一条明显的表达条带。

2. 5 融合蛋白表达与鉴定结果

对融合蛋白进行大量诱导表达，经菌液裂解及SDS-PAGE检测分析，发现其上清液与沉淀均在67.0 kD附近出现一条蛋白条带，但沉淀中的蛋白含量明显高于上清液中的含量（图5），表明融合蛋白主要以包涵体形式表达。

2. 6 融合蛋白的提取与纯化结果

大肠杆菌B21（DH3）表达的Lck融合蛋白主要以包涵体存在。重组表达细菌经IPTG诱导、超声波裂解、离心沉淀和重悬后，加入Ni-NTA树脂层析柱中进行纯化，纯化产物10倍稀释后，经SDS-PAGE检测分析，结果显示在67.0 kD处有一条清晰的条带（图6）。

2. 7 Lck融合蛋白血清抗体的免疫效价

抗原采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液分别包被，以ELISA分别检测Lck融合蛋白免疫日本大耳白兔的抗体效价，结果发现多克隆抗体的效价为1∶256000（图7），表明誘导表达获得的Lck融合蛋白可诱导日本大耳白兔产生良好的免疫反应，且抗体效价较高。

2. 8 Western blotting检测结果

纯化Lck融合蛋白的Western blotting检测结果见图8。25和10 ng融合蛋白在67.0 kD处均出现一条能与阳性血清反应的清晰蛋白条带，且以25 ng融合蛋白的条带更清晰，而免疫前阴性血清对照组在相应位置未见任何条带，说明Lck多克隆抗体具有较高的特异性。

2. 9 抗体纯化结果

收集到的抗血清采用Protein G亲和层析柱进行两次纯化，经4倍稀释后进行SDS-PAGE检测分析，结果发现在50.0和25.0 kD附近各出现一条清晰条带（图9），其大小与抗体重链及轻链的大小相吻合。经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上，纯度约95%，抗体纯化效果良好。

3 讨论

Lck在介导T淋巴细胞免疫反应中起关键作用，在T淋巴细胞发育和功能分化的各阶段几乎都有Lck参与，但目前针对鱼类Lck的相关功能研究甚少。Gan等（2015）克隆了尼罗罗非鱼Lck基因，并证实该基因编码501个氨基酸，蛋白理论分子量57.25 kD，理论等电点5.07;Taylor等（2015）研究发现，克隆性T淋巴细胞系可特异性表达Lck和CD2，而Lck可与斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中的CD2、CD4-1和CD4-2 T淋巴细胞共同受体结合;Liu等（2017）研究发现，Lck/Hck/Fgr介导的TBK1酪氨酸磷酸化对斑马鱼抗病毒免疫性具有负调节作用。本研究结果表明，尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值（GRAVY）为-0.454，属于亲水性蛋白，具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点，无典型的跨膜区;采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck，经原核诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD，但该蛋白的理论分子量应为57.25 kD，可能与其在大肠杆菌中的修饰过程及加入His-Tag有关。

本研究中，IPTG诱导表达获得的融合蛋白经SDS-PAGE检测分析发现，其上清液和沉淀均在67.0 kD处出现一条蛋白条带，但沉淀中的蛋白含量明显高于上清液中的含量，说明诱导表达的Lck融合蛋白存在可溶性及不溶性两种形式，但主要以不溶性的包涵体形式存在。在大肠杆菌表达期间，融合蛋白通常需要折叠调节剂如分子伴侣蛋白的帮助。在高效表达系统中，蛋白聚集的速度一般比正确折叠的速度快，分子伴侣蛋白易被迅速用完（Baneyx and Mujacic，2004），因此这些蛋白聚集后即形成不溶性的包涵体。由于融合蛋白聚集被认为是一个亟待解决的问题而非研究目标（Rinas et al.，2017），导致包涵体形成的生理和生物学特性一直被忽视。包涵体的形成一般认为与原核载体系统的高效表达有关（Carrió et al.，2000），而细菌胞浆环境条件的降低（Singh and Panda，2005）、拥挤的环境（Magno et al.，2010）及缺乏真核伴侣和翻译后机制（Carrió et al.，2000）有助于包涵体的形成。此外，蛋白乙酰化会对内源性大肠杆菌蛋白的聚集、产量、溶解度及融合蛋白的生物活性产生影响，如赖氨酸乙酰化增加会促进形成稳定的蛋白质聚集体（Kuczyńska-Wi?nik et al.，2016）。由于靶蛋白更容易从细菌裂解物中的可溶性部分纯化，因此包涵体的形成通常被认为是大肠杆菌表达系统的缺点（Clark，2001），而改变表达菌生长条件（生长温度、诱导剂浓度和诱导时间）有助于减少包涵体的形成，增加可溶性蛋白含量。

日本大耳白兔以耳大、血管清晰而著称，是制备抗体的最适动物模型。其性情温顺，体型适中，便于实验操作;每次可收集高达10～50 mL的血液量或120～200 mL的总血液量，免疫后可产生足量的高亲和力抗血清。因此，本研究以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体，Western blotting和ELISA检测结果显示，制备的Lck多克隆抗体具有较高的特异性与免疫效价，也说明日本大耳白兔是制备多克隆抗体的理想动物模型。本研究结论不仅为尼罗罗非鱼Lck蛋白功能及作用机制的研究提供了依据，还为解释Lck在鱼类免疫反应和细胞增殖等过程中的作用打下了基础。

4 结论

经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性，其免疫日本世纪大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性，可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究。

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