宽体金线蛭基因组SSR序列特征分析及其分子标记开发

熊良伟 王帅兵 岳丽佳 王建国 陶桂庆 徐亮 王权

摘要：【目的】分析宽体金线蛭基因组SSR序列特征，并开发多态性SSR分子标记，为宽体金线蛭种质遗传多样性分析及良种选育等提供有效的分子标记。【方法】利用基因组de novo测序技术对宽体金线蛭基因组进行扫描，通过序列拼接得到基因组序列，利用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位点，分析SSR序列特征并使用PRIMER3 Input（version 2.3.7）设计引物，随机选择三碱基、四碱基和五碱基SSR分子标记引物50对对8份宽体金线蛭DNA样品进行PCR验证，并以多态性SSR分子标记分析宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性。【结果】测序拼接共得到148803个scaffolds序列，scaffold序列长度181～564229 bp，平均1544 bp，总长度230 Mb，N50为5948 bp，GC含量36.94%。宽体金线蛭基因组中三碱基重复SSR位点最多，有136890个，占总SSR位点的68.43%;其次为四碱基重复，有33769个，占总SSR位点的16.88%;六碱基、五碱基、二碱基和单碱基重复分别有11813、7110、6546和3907个，占总SSR位点的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%。基序为AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位点数量最多，其次为ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/GTT，其他基序位点数量较少。有11871个SSR位点设计出引物，占总SSR位点的5.93%;选择的50對引物中有18对引物在8份宽体金线蛭DNA样品中具有多态性;群体遗传多样性检测发现宽体金线蛭江苏高邮群体18个SSR位点的平均等位基因（Na）3.81个，观测杂合度（HO）为0.0000～0.6429，平均为0.3631，期望杂合度（He）0.0701～0.7792，平均为0.4869，群体遗传多样性水平低。【结论】采用高通量测序技术开发SSR分子标记效率高，且新开发的18个宽体金线蛭SSR分子标记多态性丰富，可用于宽体金线蛭资源保护和利用。

关键词： 宽体金线蛭;基因组;de novo测序;SSR分子标记;遗传多样性

中图分类号： S966.9                       文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2298-06

SSR sequence characters for genome of Whitmania pigra Whitman and development of molecular markers

XIONG Liang-wei1， WANG Shuai-bing1， YUE Li-jia1， WANG Jian-guo1，

TAO Gui-qing2， XU Liang3， Wang Quan1*

（1Department of Aquatic Science and Technology， Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou， Jiangsu 225300， China; 2Jingjiang Mingxing Leech Science & Technology Co.， Ltd.， Jingjiang， Jiangsu  214500， China;

3Taizhou Haiwei Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd.， Taizhou， Jiangsu  225300， China）

Abstract：【Objective】In order to provide the appropriate molecular markers for assessment of germplasm genetic diversity and fine species breeding of Whitmania pigra Whitman， the characteristics of SSR sequence of the genome were analyzed and new polymorphic SSR molecular markers were developed. 【Method】W. pigra was used for a genomic do novo sequencing by scanning. Then the genomic sequences were assembled， and SSR loci were identified from the assembled sequences using Tandem Repeats Finder（version 4.09）. The characteristics of the SSR sequence were analyzed and the primers were designed using PRIMER3 Input（version 2.3.7）. A subset of 50 primer pairs with the motif of tri-， tetra- and penta-nucleotide was randomly selected for PCR test using the genomic DNA of a panel of eight individuals of W. pigra. The polymorphic SSR molecular markers were used for genetic diversity analysis of Gaoyou population in Jiangsu Pro-vince. 【Result】A total of 230 Mb of sequence data were obtained from 148803 scaffolds sequences with a length range from 181 bp to 564229 bp. The average length of the scaffolds was 1544 bp， and the N50 was 5948 bp. The content of GC was 36.94%. The most abundant repeat SSR loci in W. pigra genome was tri-nucleotide with the number of 136890， accounting for 68.43% of the total number， followed by tetra-nucleotide 33769（16.88%）. And hexa-nucleotide 11813（5.91%）， penta-nucleotide 7110（3.55%）， di-nucleotide 6546（3.27%） and mono-nucleotide 3907（1.95%） repeat units were also observed. The motif with the most frequent SSR loci were AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT motifs， followed by ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA motifs， AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC motifs and AAC/ACA/CAA/TTG/TGT/ GTT motifs， while the others were comparatively scarce. A total of 11871 SSR loci designed primers， which accounted for 5.93% of the total SSR loci. Eighteen primer pairs out of the 50 primer pairs presented polymorphism in W. pigra DNA samples. In a population genetic diversity analysis of individuals from Gaoyou County， Jiangsu Province with the 18 primer pairs， the average number of alleles per locus（Na） was 3.81. The observed heterozygosities（Ho） ranged from 0.0000 to 0.6429，with a mean value of 0.3631， the expected heterozygo stities（He） was 0.0701-0.7792 with an average of 0.4869， indicating a low level of genetic diversity. 【Conclusion】The method to develop SSR molecular markers through high-throughput sequencing is efficient. The 18 developed SSR molecular markers of W. pigra are polymorphic， which will be useful in conservation and management of W. pigra resources.

Key words： Whitmania pigra Whitman; genome; de novo sequencing; SSR molecular marker; genetic diversity

0 引言

【研究意義】宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman）俗称蚂蟥，是《中国药典》药材水蛭的主要基原动物，其干燥后可全体入药，具有破血通经、逐瘀消癥的功效（郭坤等，2017），是当前人类心脑血管疾病防治药物的主要原料。由于宽体金线蛭具有较高的药用价值和经济价值，其市场销售供不应求，进而推动宽体金线蛭人工养殖迅速发展，现已成为江苏、湖北、安徽等地的特色产业（刘飞和杨大坚，2014）。在人工养殖过程中，繁殖亲蛭需每年3—4月从天然水体中捕获，不同来源地的亲蛭混杂严重，且宽体金线蛭野生资源遭到破坏，种质污染风险高，因此迫切需要开展宽体金线蛭种质资源保护工作。【前人研究进展】目前，关于宽体金线蛭的研究主要集中在人工繁殖和养殖方面（熊良伟等，2016，2017;戴道新等，2017;郭坤等，2017）;由于缺乏有效的分子标记，针对宽体金线蛭种质遗传多样性和分子标记辅助育种的研究甚少。微卫星又称简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），是一种共显性分子标记，具有操作简单、重复性好、多态性高等特点，在种质遗传多样性分析、亲权分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等领域得到广泛应用（Zhang et al.，2006;赵志英等，2018），但SSR分子标记具有种质特异性，应用前需进行开发。采用传统磁珠富集法开发SSR分子标记效率低且成本高（Zane et al.，2002），而利用高通量测序技术开发SSR分子标记能极大提高开发效率，并有效降低成本，已成功应用于二长棘鲷（Parargyrops edita）（杨兵等，2015）、青石斑鱼（Epinephelus awoara）（高峰涛等，2017）、曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）（吕振明等，2017）、中华鳑鲏（Rhodeus sinensis）（Xiong et al.，2017）等非模式动物的SSR分子标记开发。【本研究切入点】至今，尚无利用高通量测序技术开发宽体金线蛭SSR分子标记的研究报道。【拟解决的关键问题】通过基因组de novo测序技术对宽体金线蛭基因组进行扫描，查找出SSR位点，并分析其SSR序列特征及开发多态性SSR分子标记，为宽体金线蛭种质遗传多样性分析和良种选育等提供有效的分子标记。

1 材料与方法

1. 1 样本采集

2017年3月从江苏省高邮地区收集性成熟宽体金线蛭28尾，体重21.45±5.91 g/尾，经江苏农牧科技职业学院熊良伟博士鉴定为W. pigra。取宽体金线蛭体侧壁肌肉为组织样品，采用苯酚—氯仿法抽提其基因组DNA，再分别以琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的完整性及其浓度。检测合格后随机挑选一份宽体金线蛭DNA样品送至苏州金唯智生物科技有限公司进行基因组de novo测序。

1. 2 基因组de novo测序与序列拼接

使用NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?试剂盒构建DNA文库，具体操作：选取2 ?g基因组DNA用超声波破碎仪（Covaris S220）随机打断成小于500 bp的片段，通过End Prep Enzyme Mix进行粘性末端修复（包括5'末端磷酸化和3'端加碱基A），两端加测序接头后使用AxyPrep Mag PCR Clean-up纯化410 bp左右的片段，用引物P5（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3'）和P7（5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'）进行扩增，然后以Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）和Qubit 2.0荧光光度计（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分别检测DNA文库的质量和浓度。

DNA文库建好后，按Illumina HiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）仪器使用说明进行2*300 bp双端测序，由HiSeq自带的HiSeq Control Software （HCS）+OLB+GAPipeline-1.6读取序列信息。测序结果（原始图像数据）利用bcl2fastq v2.17.1.14进行图像碱基识别，经初步质量分析后得到测序样本的原始数据;以Cutadapt v1.9.1对原始数据进行优化处理：①去除引物及接头序列;②去除两端质量值低于20的碱基;③去除含N比例高于10%的原始序列;④去除长度小于75 bp的序列。基于优化后的数据，以Velvet 1.2.10拼接出分段的contig序列，再用SSPACE v3.0将contig序列进一步组装得到scaffold序列，最后采用GapFiller（version 1-10）将scaffold序列延伸得到N比例较低、序列较长的scaffold序列。

1. 3 SSR位点查找及引物设计

采用Tandem Repeats Finder v4.09查找拼接序列SSR位点（Benson，1999），查找位点包括单碱基～六碱基重复，且要求单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基最少重复次数分别为13、6、5、5、5和5次。使用PRIMER3 Input（version 2.3.7）对查找到的SSR位点设计引物（Untergasser et al.，2012），主要设计参数：退火温度（Tm）57～63 ℃，上、下游引物Tm相差小于5 ℃;扩增产物大小100～280 bp;扩增引物长度18～27 bp，GC含量40.00%～65.00%。

1. 4 PCR检测

随机挑选三碱基、四碱基和五碱基重复SSR位点引物50对，用8份宽体金线蛭DNA样品进行PCR扩增验证，检测其扩增效果。PCR反应体系10.0 ?L，其中DNA模板（10.0 ng/?L）1.0 ?L，正、反向引物（10.0 ?mol/L）各0.5 ?L，2×Taq PCR Master Mix 5.0 ?L，双蒸水3.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s，退火45 s，72 ℃ 45 s，进行30个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，参照杨兵等（2015）的方法进行银染及显色，最后将胶片平铺到观片灯上用数码相机拍照保存。

1. 5 群体遗传多样性分析

选择扩增条带清晰且呈多态性的SSR分子标记检测宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性，PCR反应体系和扩增程序同1.4。根据PCR扩增产物电泳条带位置确定每个样品各SSR位点的基因型，用Micro-Checker 2.2.3分析各SSR位点是否存在无效等位基因（Van Oosterhout et al.，2010），以PopGen32分析群体各位点的等位基因数（Na）、观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He），并采用Genepop 4.0进行哈代—温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验和连锁不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析（Rousset，2008）。

2 结果与分析

2. 1 基因组测序拼接结果

宽体金线蛭的de novo测序共获得48988112个原始序列，序列平均长度300 bp，共有碱基1470 Mb，碱基GC含量38.44%，Q30为79.03%。原始序列经优化处理后，Q30为93.43%，大于75.00%，说明测序质量良好，可用于拼接。拼接结果显示，共获得148803个scaffolds序列，scaffold序列长度181～564229 bp，平均1544 bp;scaffold序列总长230 Mb，N50为5948 bp，GC含量36.94%。

2. 2 基因組SSR序列特征分析结果

在拼接的scaffold序列中共查找到200035个SSR位点，单碱基～六碱基重复序列均有存在，但不同碱基数量重复类型数量存在明显差异（图1）。其中，三碱基重复SSR位点最多，有136890个，占总SSR位点的68.43%;其次为四碱基重复，有33769个，占总SSR位点的16.88%;六碱基、五碱基、二碱基、单碱基重复分别有11813、7110、6546和3907个，占总SSR位点的5.91%、3.55%、3.27%和1.95%。由图1还可看出，不同碱基类型重复位点数量也不一样，宽体金线蛭基因组中AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的重复数量最多，其次为ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA、AGT/GTA/TAG/TCA/CAT/ATC和AAC/ACA/CAA/ TTG/TGT/GTT，其他重复类型相对较少。

2. 3 SSR位点的PCR验证结果

查找到的SSR位点中共有11871个位点设计出引物，占总SSR位点的5.93%。在选取的50对引物中，有8对引物（占16.00%）无任何扩增产物;有4对引物（占8.00%）的扩增片段复杂，如图2中的WP42位点;其余38对引物（占76.00%）有清晰扩增产物，且扩增产物大小与预期结果相符，如图2中的WP39、WP40和WP41位点，但有20对引物的扩增产物不具多态性，如图2中的WP41和WP43位点。

2. 4 群体遗传多样性分析结果

18对多态性引物从宽体金线蛭群体（28份样品）中扩增出的条带多态性较丰富，每个SSR位点检测到等位基因2～7个，平均3.81个。图3为WP54和WP59位点在宽体金线蛭群体样品中的扩增结果。检测宽体金线蛭群体的Ho为0.0000～0.6429，平均为0.3631;He为0.0701～0.7792，平均为0.4869（表1）。其中，WP3、WP7、WP20和WP48 4个SSR位点检测发现存在无效等位基因。HWE检验结果显示，有4个SSR位点（WP3、WP7、WP20和WP48）显著偏离平衡（P<0.05）;而LD分析结果表明，WP23和WP54位点间存在连锁关系（P<0.05）。

3 讨论

SSR分子标记的传统开发方法是先通过富集得到含SSR基因组片段，经测序分析后合成引物进行PCR验证（Zane et al.，2002），但由于对开发物种基因组缺乏了解，富集文库具有盲目性，且富集得到的DNA片段长度有限，部分SSR位点无法设计出引物，导致开发效率低、成本高。Liu等（2013）利用富集法和SAMPL法共开发获得宽体金线蛭SSR标记14个，其中三碱基重复类型1个，其余均为二碱基重复。本研究利用高通量测序技术开发出11871条宽体金线蛭候选SSR分子标记，包括单碱基～六碱基重复类型，开发效率较高，从50个候选标记中开发出18个三碱基～五碱基重复的多态性SSR分子标记，新开发标记基序更长，可有效提高宽体金线蛭个体SSR分子标记分型准确性。

水蛭作为一种非模式生物，对其基因组信息了解甚少。Simakov等（2013）为了阐明两侧对称动物的进化关系，对加利福尼亚蛭（Helobdella robusta）、海蠕虫（Capitella teleta）和青贝（Lottia gigantea）3种动物基因组进行测序、拼装和注释，结果发现加利福尼亚蛭基因组相对较小，仅228 Mb，GC含量33.00%，该结论为其他蛭类基因组学研究提供了重要参考。本研究对宽体金线蛭基因组进行de novo测序和拼接，原始序列经过优化处理后Q30达93.43%，测序质量高，拼接后序列GC含量36.94%，长度为230 Mb，与加利福尼亚蛭的GC含量和基因组大小相近，即本研究开发的微卫星标记能完全体现宽体金线蛭基因SSR信息特征。

曾晓芸等（2015）研究表明，裸体异鳔鳅鮀（Xe-nophysogobio nudicorpa）基因组中二碱基重复占总SSR位点的83.15%，三碱基重复占总SSR位点的14.05%;倪守胜等（2018）研究表明，虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）基因组中二碱基和三碱基重复占总SSR位点的比例较高，分别为37.05%和45.17%，表明不同水产动物基因组SSR类型存在明显差异。本研究结果显示，宽体金线蛭基因组SSR位点以三碱基重复序列为主，占总SSR位点68.43%，单碱基和二碱基重复序列较少，占总SSR位点的比例均在5.00%以下。王斌等（2017）通过对棒纹牛蛭（Poecilobdella javanica）、日本医蛭（Hirudo nipponia）、宽体金线蛭和洞穴山蛭（Heamadipsa cavatuses sp.nov.）4种蛭类进行RNA测序和转录组分析，发现三碱基重复序列占各种蛭类SSR位点类型的47.00%以上，其中宽体金线蛭三碱基重复序列达68.00%。该结论在本研中得到进一步证实，即宽体金线蛭基因组和EST序列中三碱基重复SSR位点中基序为AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT的SSR位点比例最高。

Liu等（2016）利用SSR和TRAP分子标记对我国江苏和浙江等11个区域野生宽体金线蛭群体进行分析，发现野生群体遗传多样性水平较低，但种群间存在较高水平的遗传分化。本研究选择50对SSR引物在8份宽体金线蛭DNA样品中进行检测，结果发现有38对引物的扩增产物大小与预期结果相符，且条带型清晰，但仅有18个SSR位点具有多态性，群体遗传多样性检测发现宽体金线蛭江苏高邮群体18个SSR位点的平均等位基因3.81个，平均Ho和He分别为0.3631和0.4869，说明宽体金线蛭江苏高邮群体遗传多样性水平较低，也提示开展宽体金线蛭地方种群保护十分必要。

4 结论

采用高通量测序技术开发SSR分子标记效率高，且新开发的18个宽体金线蛭SSR分子标记多态性丰富，可用于宽体金线蛭资源保护和利用。

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