奥尼罗非鱼GHR2基因序列及其表达特征分析

钟欢 张孝瑾 肖俊 唐瞻杨 郭忠宝 罗永巨 周毅

摘要：【目的】深入了解生長激素受体2（GHR2）基因在奥尼杂交罗非鱼及其亲本（尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼）中的表达差异，为研究杂交过程中GHR基因的结构及功能变化提供依据，也为鱼类杂交育种提供理论支撑。【方法】利用SOAPdenovo从奥尼罗非鱼肝脏转录组数据中提取GHR2基因序列，采用BioEdit 7.0.5.3比对奥尼罗非鱼及其亲本的GHR2氨基酸序列差异，以MEGA 4.1进行系统进化分析及构建系统发育进化树，并利用实时定量PCR分析GHR2基因在奥尼罗非鱼不同组织中的表达情况及其在奥尼罗非鱼和亲本中的表达差异。【结果】拼接获得的奥尼罗非鱼GHR2基因开放阅读框为1722 bp，共编码574个氨基酸，相对分子量为64.18 kD，理论等电点为4.86;奥尼罗非鱼GHR2氨基酸序列包含一个保守的信号肽和一段跨膜区。基于GHR2氨基酸序列构建的系统发育进化树显示，奥尼罗非鱼与尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼存在高度相近的亲缘关系，尤其与母本（尼罗罗非鱼）的亲缘关系最近。GHR2基因在奥尼罗非鱼不同组织中均有表达，以在肝脏中的表达量最高，显著高于除肌肉外的其他组织（P<0.05），其次是肌肉、卵巢、心脏和垂体，在头肾中的表达最低。GHR2基因在奥尼罗非鱼肝脏和肌肉中的表达量明显高于其双亲（尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼）的表达量。【结论】GHR2基因属于广泛表达基因，在奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼中高度保守;GHR2基因在奥尼罗非鱼中的表达优势与其快速生长的杂种优势有关。

关键词： 奥尼罗非鱼;生长激素受体2（GHR2）;亲缘关系;表达差异;非加性表达模式

中图分类号： S965.125                                 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2292-06

The sequence and expression characteristic of GHR2 gene in Oreochromis niloticus（♀） × O. aureus（♂）

ZHONG Huan1， ZHANG Xiao-jin1，2， XIAO Jun1， TANG Zhan-yang1，

GUO Zhong-bao1， LUO Yong-ju1，2， ZHOU Yi1*

（1Tilapia Genetic Breeding Center， Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning  530021， China; 2College of Fisheries & Life， Shanghai Ocean University， Shanghai  201306， China）

Abstract： 【Objective】The present study aimed to understand the expression differentiation of growth hormone receptor 2（GHR2） gene in Oreochromis niloticus（♀）×O. aureus（♂） and its parents. This study provided evidence for GHR gene structural and functional changes in hybridization process and supplied theoretical support for cross breeding in fish. 【Method】Using SOAPdenovo software， the GHR2 gene sequence of O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） was extracted from liver transcriptome. The alignment analysis between O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） and its parents was performed by BioEdit 7.0.5.3 software. MEGA 4.1 package was used to conduct phylogenetic analysis and construct the phylogenetic tree. Realtime quantitative PCR was employed to investigate the GHR2 gene expression in different tissues from O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） and the differential expression between O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） and its parents. 【Result】The assembled gene GHR2 from O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） contained a 1722 bp open reading frame， encoded 574 amino acids. The relative molecular mass was 64.18 kD and the theoretical isoelectric point was 4.86. A conserved signal peptide and a transmembrane region were found in GHR2 amino acid sequence in O. niloticus（♀）×O. aureus（♂）. The constructed phylogenetic tree based on GHR2 amino acid sequence revealed high similarity among O. niloticus（♀）×O. aureus （♂）， Nile tilapia and Blue tilapia， especially between O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） and its maternal（Nile tilapia）. GHR2 gene expressions were found in all the tested tissues in Nile tilapia. The highest expression was found in liver， which was signifi-cantly higher than other tissues except muscle（P<0.05）. The GHR2 expressions were moderate in muscle， ovary， heart and pituitary. The expression in head-kidney was the lowest. The expressions of GHR2 in liver and muscle were significantly higher than those in its parents（Nile tilapia and blue tilapia）. 【Conclusion】Gene GHR2 is a widespread expression gene and is highly conserved in O. niloticus（♀）×O. aureus（♂）， Nile tilapia and blue tilapia. The expressive advantage of GHR2 in O. niloticus（♀）×O. aureus（♂） is related to its rapidly growing heterosis.

Key words： Oreochromis niloticus（♀）×O. aureus（♂）; growth hormone receptor 2（GHR2）; phylogenetic relationship; expression differentiation; non-additive expression

0 引言

【研究意义】奥尼罗非鱼是尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus ♀）与奥利亚罗非鱼（O. aureus ♂）杂交获得的后代（李家乐等，1997），因其具有雄性率高、耐低温、抗逆性好、生长速度快等杂种优势，已成为我国罗非鱼养殖产业中的主要品种之一。GH-IGF（Growth hormone-insulin-like growth factor）轴是控制鱼类生长的关键通路。垂体分泌的生长激素（Growth hormone，GH）需与其受体（Growth hormone receptor，GHR）结合才能将信号传递到靶细胞，诱发其分泌相关生长因子，如胰岛素样生长因子1（IGF-1），从而促进鱼类生长发育（Reinecke et al.，2005）。因此，了解GHR在奥尼罗非鱼中的表达特征，对阐明其快速生长的机制具有重要意义。【前人研究进展】奥尼罗非鱼具有快速生长的杂种优势，其F1代群体的平均优势为15.1%～30.6%（颉晓勇等，2007）。目前，针对鱼类杂种优势的研究已有较多报道。在棕点石斑鱼（Epinephelus fuscogutatus ♀）×鞍带石斑鱼（E. lanceolatus ♂）的F1代中，GH-IGF轴关键基因具有表达优势，推断其与杂交石斑鱼的杂种优势有关（Sun et al.，2016）。在GH-IGF轴中，GHR是连接GH和IGF-1的关键蛋白分子（Reindl and Sheridan，2012），属于细胞因子受体超家族的成员，是一种跨膜蛋白（Reinecke et al.，2005）。在接受GH时，通过二聚化集合可激活蛋白激酶JAK2信号通路，诱导细胞内信号变化（Herrington and Carter-Su，2001）。在靶细胞中，GH与GHR结合，诱导靶细胞如肌肉和肝脏细胞分泌IGF-1，最终促进机体生长（Moriyama et al.，2000）。已有研究表明，在罗非鱼中不同GHR基因型会影响IGF-1的表达水平（Liu et al.，2014）。在尼罗罗非鱼中存在两种GHR（GHR1和GHR2），其肝脏中GHR1的mRNA表达水平在110日龄最高，而GHR2在60日龄时表达最高，提示这两种GHR在罗非鱼生长周期中行使功能的时间存在明显差异（马细兰等，2009）。此外，尼罗罗非鱼GHR受性激素调节（Yue et al.，2018），且微胞藻应激可改变GHR的表达（Chen et al.，2017）。【本研究切入点】目前，有关奥尼杂交罗非鱼快速生长机制的研究报道较少，尤其是奥尼罗非鱼GHR基因序列及其表达特征均有待进一步研究，旨在阐明杂种优势的产生机理。【拟解决的关键问题】通过高通量测序技术提取奥尼罗非鱼GHR2基因序列，深入了解该基因在奥尼杂交罗非鱼及其亲本中的表达差异，为研究杂交过程中GHR基因的结构及功能变化提供依据，也为鱼类杂交育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼（1龄）均由广西水产科学研究院国家级南宁市罗非鱼良种场提供。RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒及实时定量PCR所用的SYBR Green均购自宝日医生物技术（北京）有限公司;实时定量PCR引物由上海英潍捷基生物公司合成。

1. 2 数据来源及生物信息学分析

奥尼罗非鱼GHR2基因序列来自其肝脏转录组测序结果，利用SOAPdenovo获得拼接后的GHR2基因序列;其他用于序列比对和系统进化分析的序列下载于NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），序列號分别为：虹鳟（Oncorhynchus mykiss）AAT76435.2，大西洋鲷（Sparus aurata）AAT76436.1，黑棘鲷（Acanthopagrus schlegelii）AAV83932.4，斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）ABM21633.1，鲤鱼（Cyprinus carpio）ADC35577.1，黄鳍鲷（Acanthopagrus latus）AEW29012.1，花鲈（Lateolabrax japonicus）AGD 80843.1，鳜鱼（Siniperca chuatsi）AHY22366.1，尼罗罗非鱼（O. niloticus）AY973233.1，奥利亚罗非鱼（O. aureus）KJ845729.1。采用BioEdit 7.0.5.3对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼的GHR2氨基酸序列进行比对分析，以MEGA 4.1进行系统进化分析并构建系统发育进化树。

1. 3 RNA提取和第一链cDNA合成

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼不同组织的总RNA均采用RNAiso Plus试剂盒进行提取，并以1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）的试剂盒说明合成第一链cDNA。

1. 4 实时定量PCR

实时定量PCR引物采用Primer Express v.3.0根据3种罗非鱼的保守序列设计，具体引物序列如下：GHR2-F：5'-CACACCTCGATCTGGACATATTACA-3';GHR2-R：5'-CGGTTGGACAATGTCATTAACAA-3';β-actin-F：5'-CCACAGCCGAGAGGGAAAT-3';β-actin-R：5'-CCATCTCCTGCTCGAAGTC-3'。以β-actin为内参基因。反应体系25.0 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，灭菌水9.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。经PCR扩增后，进行熔解曲线分析以确定扩增是否特异。相对定量值采用2-ΔΔCt进行计算（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 5 统计分析

采用SPSS 16.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukeys检验。

2 结果与分析

2. 1 GHR2基因序列分析结果

从转录组结果中拼接获得奥尼罗非鱼GHR2基因的cDNA序列，其开放阅读框为1722 bp，共编码574个氨基酸，相对分子量为64.18 kD，理论等电点为4.86。GHR2基因的核苷酸及其推导氨基酸序列如图1所示。从结构上来看，奥尼罗非鱼GHR2氨基酸序列包含一个保守的信号肽和一段跨膜区，与目前已报道的尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼GHR2氨基酸序列一致。

氨基酸序列比对分析结果也说明奥尼罗非鱼的GHR2与其亲本高度相似（图2）。由构建的系统发育进化树（图3）也可看出，3种罗非鱼存在高度相近的亲缘关系，尤其与母本（尼罗罗非鱼）的亲缘关系最近。同属鲈形目的多种鱼类聚类为一大分支，而虹鳟和鲤鱼与这些鲈形目物种有较远的亲缘关系。

2. 2 GHR2基因组织表达分析结果

采用实时定量PCR分析奥尼罗非鱼不同组织中GHR2基因的表达水平，结果表明，GHR2基因在所检测的10个组织中均有表达（图4），属于广泛表达的基因。其中，在肝脏中的表达量最高，显著高于除肌肉外的其他组织（P<0.05，下同）;其次是肌肉、卵巢、心脏和垂体，在头肾中的表达量最低。

2. 3 奥尼罗非鱼与亲本的GHR2基因表达比较

采用实时定量PCR对比分析GHR2基因在奥尼罗非鱼和亲本（尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼）肝脏中的表达情况，结果显示，GHR2基因在雄性罗非鱼肝脏中的表达量排序为奥尼罗非鱼>奥利亚罗非鱼>尼罗罗非鱼，且在奥尼罗非鱼的表达量显著高于其亲本（图5-A）;在雌性罗非鱼肝脏中，尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼的GHR2基因表达量较高，二者间无显著差异（P>0.05，下同），但显著高于奥利亚罗非鱼的表达量（图5-B）。

GHR2基因在奥尼罗非鱼和亲本（尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼）肌肉中的表达情况表现为：GHR2基因在雄性尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼肌肉中的表达无显著差异（图6-A），其表达量排序为奥尼罗非鱼>奥利亚罗非鱼>尼罗罗非鱼;在雌性罗非鱼肌肉中，以奥尼罗非鱼肌肉中的GHR2基因表达量最高，显著高于其亲本肌肉中的表达量（图6-B）。

3 讨论

鱼类的生长受下丘脑—垂体—肝脏轴所调节。其中，下丘脑分泌促生长激素释放激素（Growth hormone releasing hormone，GHRH），与垂体中的受体GHRHR结合后，刺激垂体中的GH分泌;GH随循环系统释放到各器官组织中，与其受体GHR结合，促进靶细胞分泌IGF-1。IGF-1是生长轴下游的多肽类激素，主要由肝脏分泌（Berryman et al.，2008），通过与其受体IGFR结合而促进组织生长发育。可见，这些生理功能的发挥必须依靠与激素受体的特异性结合才能实现。目前，已在鱼类中克隆获得两种GHR（GHR1和GHR2），如在尼罗罗非鱼（Pierce et al.，2012）和桑给巴尔罗非鱼（O. hornorum）（Gao et al.，2011）中已克隆获得GHR1和GHR2的基因全序列。在奥利亚罗非鱼中仅限于GHR2，尚无GHR1的相关报道（Liu et al.，2014）。本研究通过高通量测序技术提取奥尼罗非鱼GHR2基因序列，结果发现奥尼罗非鱼GHR2基因序列中含有典型的跨膜结构，且其跨膜区域的氨基酸序列与尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的序列高度一致，揭示了奥尼罗非鱼中GHR2结构的保守性。从基于GHR2氨基酸序列构建的系统发育进化树也可看出，3种罗非鱼存在高度相近的亲缘关系，尤其与母本（尼罗罗非鱼）的亲缘关系最近。杂交是快速获得优良变异后代的主要方式之一，基因组快速融合是杂种优势的驱动力，因此奥尼罗非鱼GHR2基因序列的变化可能与其快速生长优势有关。

GH作用的靶组织非常广泛，因此GHR分布于各组织细胞的细胞膜上，能启动下游磷酸化级联反应和基因表达。在尼罗罗非鱼（Ma et al.，2007）、桑给巴尔罗非鱼（Gao et al.，2011）和暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）（Cheng et al.，2015）中，GHR2已被证实在各组织中均有表达，且以肝脏中的表达量最高。本研究结果表明，GHR2基因在奥尼罗非鱼肝脏和肌肉中的表达量较高，与其他鱼类的研究结果一致，间接证明GHR2在功能上的保守性。GHR表达水平与机体生长存在明显的相关性。在罗非鱼中，GHR2与IGF-1和IGF-2的表达存在相关性（Phumyu et al.，2012），说明GHR2除了能与GH结合外，还参与调节GH-IGF轴。在莫桑比克罗非鱼中，雌性个体的GHR2基因表达水平低于雄性个体，即GHR2的表达优势与雄性莫桑比克罗非鱼的生长优势相关（Davis et al.，2008）。本研究中，GHR2基因在雄性和雌性奥尼罗非鱼肝脏中均呈高水平表达，且表达水平明显高于亲本。肝脏是IGF-1的主要分泌部位，在GHR接受到GH信号后，肝脏细胞启动级联反应并诱导IGF-1分泌。肌肉是鱼类生长的关键组织，虽然GHR2基因在雄性奥尼罗非鱼肌肉中未表现出明显的表达优势，但在肝脏中呈现明显优势。GH-IGF轴是一个整体的内分泌调控轴，除了GHR2外，还有GH、IGF-1等多个因子共同作用，因此GH和IGF-1在雄性奥尼罗非鱼的表达优势有待进一步探究。

杂种优势的产生源于两个不同亲本基因组融合后的序列整合及表达调控变化，其中关键表型基因的非加性表达是导致杂种优势表现的机制之一。非加性表达模式即杂交子代中的表达水平不等于两亲本该基因平均表达水平的基因表达模式。本研究结果表明，奥尼罗非鱼肝脏和肌肉中的GHR2基因表達水平与两亲本的平均表达水平存在明显差异，可能是导致其杂交子代生长优势的主要原因，但是否与非编码RNA和甲基化组等表观遗传学调控方式有关，仍需进一步研究证实。

4 結论

GHR2基因属于广泛表达基因，在奥尼罗非鱼、尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼中高度保守;GHR2基因在奥尼罗非鱼中的表达优势与其快速生长的杂种优势有关。

参考文献：

李家乐，李晨虹，李思发，叶卫，梁德进. 1997. 不同组合尼罗罗非鱼（♀）×奥利亚罗非鱼（♂）养殖性能差异研究[J]. 上海水产大学学报，6（2）：96-101. [Li J L，Li C H，Li S F，Ye W，Liang D J. 1997. Culture performance of hybrids from different strain combinations of Oreochrmis niloticus×O. Aureus[J]. Journal of Shanghai Fisheries University，6（2）：96-101.]

马细兰，张勇，刘晓春，林浩然. 2009. 雄尼罗罗非鱼肝脏2种生长激素受体基因表达的发育性变化[J]. 中国水产科学，16（1）：1-7. [Ma X L，Zhang Y，Liu X C，Lin H R. 2009. Developmental changes of two hepatic growth hormone receptors mRNA expression in male Nile tilapia （Oreochromis niloticus）[J]. Journal of Fishery Sciences of China，16（1）：1-7.]

颉晓勇，李思发，蔡完其，叶卫，陈辉崇，喻达辉. 2007. 罗非鱼主要生长性状的杂种优势分析[J]. 南方水产，3（3）：1-7. [Xie X Y，Li S F，Cai W Q，Ye W，Chen H C，Yu D H. 2007. Heterosis analysis of main growth-related traits of tilapia[J]. South China Fisheries Science，3（3）：1-7.]

Berryman D E，Christiansen J S，Johannsson G，Thorner M O，Kopchick J J. 2008. Role of the GH/IGF-1 axis in lifespan and healthspan：Lessons from animal models[J]. Growth Hormone & IGF Research，18（6）：455-471.

Chen J，Meng S，Xu H，Zhang Z，Wu X. 2017. Effects of microcystis on hypothalamic-pituitary-gonadal-liver axis in Nile tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，98（4）：562-566.

Cheng C H，Yang F F，Liao S A，Miao Y T，Ye C X，Wang A L. 2015. Effect of acute ammonia exposure on expression of GH/IGF axis genes GHR1，GHR2 and IGF-1 in pufferfish（Takifugu obscurus）[J]. Fish Physiology and Bioche-mistry，41（2）：495-507.

Davis L K，Pierce A L，Hiramatsu N，Sullivan C V，Hirano T，Grau E G. 2008. Gender-specific expression of multiple estrogen receptors，growth hormone receptors，insulin-like growth factors and vitellogenins，and effects of 17 beta-estradiol in the male tilapia（Oreochromis mossambicus）[J]. General and Comparative Endocrinology，156（3）：544-551.

Gao F Y，Lu M X，Ye X，Huang Z H，Wang H，Zhu H P，Yang L P. 2011. Identification and expression analysis of two growth hormone receptors in zanzibar tilapia（Oreochromis hornorum）[J]. Fish Physiology and Biochemistry，37（3）：553-565.

Herrington J，Carter-Su C. 2001. Signaling pathways activated by the growth hormone receptor[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism，12（6）：252-257.

Liu F，Sun F，Xia J H，Li J，Fu G H，Lin G，Tu R J，Wan Z Y，Quek D，Yue G H. 2014. A genome scan revealed significant associations of growth traits with a major QTL and GHR2 in tilapia[J]. Scientific Reports，4：7256. doi：10.1038/srep07256.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Ma X L，Liu X C，Zhang Y，Zhu P，Ye W，Lin H R. 2007. Two growth hormone receptors in Nile tilapia（Oreochromis niloticus）：Molecular characterization，tissue distribution and expression profiles in the gonad during the reproductive cycle[J]. Comparative Biochemistry and Phy-siology，147（2）：325-339.

Moriyama S，Ayson F G，Kawauchi H. 2000. Growth regulation by insulin-like growth factor-I in fish[J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，64（8）：1553-1562.

Phumyu N，Boonanuntanasarn S，Jangprai A，Yoshizaki G，Na-Nakorn U. 2012. Pubertal effects of 17 α-methyltestosterone on GH-IGF-related genes of the hypothalamic-pitui-tary-liver-gonadal axis and other biological parameters in male，female and sex-reversed Nile tilapia[J]. General and Comparative Endocrinology，177（2）：278-292.

Pierce A L，Breves J P，Moriyama S，Uchida K，Grau E G. 2012. Regulation of growth hormone（GH） receptor（GHR1 and GHR2） mRNA level by GH and metabolic hormones in primary cultured tilapia hepatocytes[J]. General and Comparative Endocrinology，179（1）：22-29.

Reindl K M，Sheridan M A. 2012. Peripheral regulation of the growth hormone-insulin-like growth factor system in fish and other vertebrates[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，163（3-4）：231-245.

Reinecke M，Bj?rnsson B T，Dickhoff W W，McCormick S D，Navarro I，Power D M，Gutiérrez J. 2005. Growth hormone and insulin-like growth factors in fish：Where we are and where to go[J]. General and Comparative Endocrinology，142（1-2）：20-24.

Sun Y，Guo C Y，Wung K，Li X F，Xiao L，Zhang X H，You X X，Shi Q，Hu G J，Fang C，Lin H R，Zhang Y. 2016. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying growth superiority in a novel grouper hybrid（Epinephelus fuscogutatus ♀×E. lanceolatus ♂）[J]. BMC Genetics，17：24. doi：10.1186/s12863-016-0328-y.

Yue M M，Zhao J L，Tang S J，Zhao Y. 2018. Effects of estradiol and testosterone on the expression of growth-related genes in female and male Nile tilapia，Oreochromis niloticus[J]. Journal of the World Aquaculture Society，49：216-228.