鹤庆县婚前婚配及孕产期群体地中海贫血的筛查和基因分析

张 伟，曹蓉蓉，袁芝琼，来明名，杨 玲，刘云春*

（1.大理大学，云南大理 671000；2.鹤庆县妇幼保健院，云南鹤庆 671500）

地中海贫血（thalassemia，以下简称地贫），又称海洋性贫血，是由于α或β珠蛋白基因的缺失或者突变，导致相应的珠蛋白基因合成障碍，从而引起一系列的临床改变的单基因遗传性溶血性疾病，根据珠蛋白受累的不同分为不同的类型，主要为α地中海贫血（以下简称α地贫）和β地中海贫血（以下简称β地贫）；地贫最早发现于地中海故而得名，其主要高发地带为地中海沿岸地区，但研究证实在美国、印度、东南亚以及我国长江以南地区都有较高的发病率〔1〕，国内尤其以广东、广西为甚，其次在云南、贵州、四川等地都有较高的地贫携带率；在云南省地贫携带率以德宏州、西双版纳州和文山州最高〔2〕，该病呈常染色体隐形遗传且具有高度的遗传异质性，也是我国危害最严重的血红蛋白病，但目前尚无有效的治愈措施〔3〕，给家庭和社会带来了沉重的负担。大理州鹤庆地区同属云南省西部地贫高发区域，至今却没有对该地区地贫的发病报道，对大理鹤庆地区地贫的调查研究结果将填补此项空白，从而加强本地区婚前孕前检查以及产前诊断防止重型地贫胎儿出生，现将结果报道如下。

1 材料

1.1 仪器DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂），2720 Thermai cycler PCR仪（美国ABI公司），YIV-H16恒温杂交仪（亚能生物技术有限公司），SysmexXT-1800五分类血球仪（沈阳乐雅科技有限公司），TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），数显HH-4恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），DYCp-3813型电泳槽，722型可见光光度计。

1.2 血样标本取自1 303名受检查者的静脉抗凝全血2 mL。

1.3 主要试剂台州市路桥四甲生化塑料厂提供的乙酸纤维素薄膜（醋酸纤维素薄膜），洛阳艾森生物有限公司提供的DNA提取试剂盒，亚能生物有限公司提供的β地中海贫血基因检测试剂盒。

2 方法

2.1 研究对象样本来自于通过分层随机抽样确定的样本数，于2017年5月至2017年6月到云南省鹤庆县妇幼保健院婚前婚配检查夫妇、孕前咨询夫妇及孕产期检测的孕产妇，解释告知受检者及家属采样目的，征得受试者本人及家属的知情同意进行样本采集并登记其姓名、年龄、民族、家庭住址及联系方式。研究遵循的程序符合医院医学伦理委员会所制定的伦理学标准，得到了委员会的批准。

2.2 血红蛋白醋酸纤维素薄膜电泳筛查

2.2.1 材料 受检者15 μL的静脉抗凝全血，醋酸纤维素薄膜（2 cm×8 cm），浸泡醋酸纤维素膜以及电泳用的硼酸氢氧化钠缓冲液（pH 8.6），丽春红染色液，3%的醋酸溶液，染色用培养皿，离心机，电泳仪及电泳槽等。

2.2.2 检测方法 ①准备醋酸纤维素薄膜：将薄膜切成2 cm×8 cm的膜条，在毛面距离一端约1.5 cm处中间用铅笔画出一条小于膜条宽度的直线（即为点样线），再在靠近线条一端标记各种数字以便区分，将膜条均匀浸入pH 8.6的硼酸氢氧化钠缓冲液中，直至膜条完全浸透待用。②血红蛋白溶液的制备：取5 mL塑料离心管加3 mL的0.9%NaCl，将“2.2.1”项下制备好的抗凝血15 mL左右于离心管内，混匀配平后置于离心机内进行洗涤，去清液，重复3次后吸尽上清液后滴上皂素1滴，充分混匀后即得血红蛋白溶液。③点样：用镊子取出浸透好的膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液，将制备好的血红蛋白溶液置于玻璃片上，用点样胶片采用印章法进行点样。④电泳：将点样好的膜条用镊子夹取膜条两端且光面向上毛面向下置于电泳槽上，点样端置于负极，轻轻将膜条拉平，盖好盖子，打开电泳仪调节电压及时间，先将电压调至80 V进行启动平衡5～10 min，再将电压调至10 V∕cm，待肉眼观察可见红色区带于膜条中间位置则可判定血红蛋白区带完全分开即可关闭电源。⑤染色及漂洗：将电泳完的膜条用镊子轻轻取出夹住一端均匀完全浸入丽春红染色液中8～10 min，待各红色区带清晰可见即可用镊子依次取出放入漂洗液培中漂洗，直至膜条各红色区带清晰可见，膜条背景无色即可用镊子取出，用滤纸吸干，轻轻放于干净的滤纸上进行实验结果观察。

2.3 血红蛋白的定量①将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，HbA管内加入0.4 mol∕L NaOH溶液6 mL（计算时吸光度乘2），其余各管加入3 mL，于37℃水浴10 min，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却；②向HbA管中加入40%（V∕V）醋酸0.6 mL（计算时吸光度乘2），其余各管加0.3 mL，以中和部分NaOH，使色泽加深；③用520 nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值（各组分Hb%＝（Ax∕AT）×100%；AX表示各个组分蛋白质（HbA、HbA2）吸光度，AT表示各组分蛋白质的吸光度总和）。

2.4 血细胞分析用血常规管抽取受检者2 mL的静脉血，轻轻混匀后于血细胞分析仪上进行直接检测，得到血常规各项指标，主要观察受检者的平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白含量（MCH）。

2.5 诊断标准①成人型血红蛋白A2（HbA2）≥3.5%或出现某些异常血红蛋白条带（HbE），为β地贫可疑，从而进行β珠蛋白基因检测；②MCV＜82 fl，MCH＜27 pg，为可疑小细胞低色素贫血。

2.6 β珠蛋白基因检测取受检者200 uL的抗凝静脉血，进行DNA提取，应用亚能生物有限公司提供的β地中海贫血基因检测试剂盒，检测中国人常见的β珠蛋白基因17种突变，包括10种杂合突变（41-42M∕N、654M∕N、-28M∕N、71-72M∕N、17M∕N、βEM∕N、43M∕N、-29M∕N、31M∕N和-32M∕N）和7种不区分型别的突变（IVS-I-1M、27∕28M、-30M、14-15M、CAPM、IntM和IVS-I-5M），操作过程按试剂盒说明书进行。

2.7 β珠蛋白基因测序将提取的DNA送往亚能生物技术（深圳）有限公司进行测序，参考序列U01317，用DNAman和Chroma软件分析测序结果。

2.8 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料用χ2检验，血常规检测数据为计量资料采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般资料1 303例受检者中，年龄15～45岁，平均年龄（26.63±4.98）岁，其中男性152例，平均年龄（27.00±8.91）岁；女性1 151例，平均年龄（26.98±8.81）岁。1 303名受检者包含了10多种民族，其中最多的民族为白族717例，其次为汉族420例，彝族84例，而研究中检测出的31例β地贫患者中，汉族15例，白族13例，彝族3例；醋酸纤维素薄膜电泳筛查出血红蛋白异常条带31例；经过对异常条带样本进行基因诊断，有29例为CD26（GAG→AAG），2例为CD56（GGC→GAC）。

3.2 醋酸纤维素薄膜电泳筛查结果在初筛异常的31例中，结果显示为β血红蛋白异常条带，未发现α血红蛋白异常条带，其异常条带结果见图1。

图1 β血红蛋白异常条带图

3.3 β珠蛋白基因检测结果31例阳性检测者显示有29例为βEM∕N（编号6），即CD26（GAG→AAG），其中2例血红蛋白电泳异常，但基因检测结果显示为正常（编号5、30）。见图2。

3.4 β珠蛋白基因测序结果通过对异常样本的β珠蛋白基因测序显示29例为CD26杂合突变，另2例基因检测结果未见异常，经基因测序结果为CD56杂合突变。见图3。

3.5 统计分析结果

3.5.1 地贫醋酸纤维素薄膜电泳筛查以及基因诊断的民族分布 在对鹤庆地区地贫的调查研究中，一共涉及1 303例参与人数，将筛查汇总的电子表格中的数据按照民族分类并统计人数，得出31例地中海贫血的醋酸纤维素薄膜电泳筛查以及基因诊断的民族分布，其中醋酸纤维素薄膜电泳筛查与基因诊断结果未见α地贫。

在鹤庆地区筛查的1 303例受检者中，主要涉及9个民族，主要民族为汉族、白族、彝族、傈僳族及纳西族，分别为420、717、84、37、12人，分别占总筛查人数的32.23%、55.03%、6.45%、2.84%、0.92%。此外还涉及回族、怒族、拉祜族、傣族、阿昌族、侗族，占总人数的0.46%。

其中，通过对汉族与少数民族的差异比较发现，该地区β地贫的阳性情况，经χ2检验得出χ2=3.794，P=0.051，表明汉族和其他少数民族在β地贫的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 βEM∕N基因检测结果图

图3 β珠蛋白基因测序结果图（反向）

通过对鹤庆地区汉族、白族、彝族3个主要民族进行χ2检验得出：31例地贫的醋酸纤维素薄膜电泳筛查中，β地贫筛查阳性率比较差异无统计学意义。进一步对3个民族进行两两比较，采用分割χ2检验对每两个民族间的差异作统计学分析，汉族与白族比较得出，χ2=3.409，P=0.065＞0.05；汉族与彝族比较得出，P=0.750＞0.05；白族与彝族比较得出，P=0.665＞0.05。在α=0.05检验水准下，可以认为该地区汉族与白族，汉族与彝族，白族与彝族之间，其β地贫的阳性率比较差异无统计学意义，即该地区3个民族之间的β地贫的阳性率差异无统计学意义。

3.5.2 地贫醋酸纤维素薄膜电泳筛查以及基因诊断的地区分布 将1 303例筛查人群中的数据按照不同的乡镇分类并统计人数，1 303名研究对象来自于鹤庆县9个乡镇，其中来自于草海镇的人数最多，有255人，占总人数的19.57%，其次为云鹤镇，有193人，占总人数的14.81%；而携带率最高的地区为六合乡，可达5.36%，其次为龙开口镇5.10%、草海镇3.53%，其中草海镇在9个乡镇的比重最高，占29.03%，其次为龙开口镇（16.13%）、金敦乡（12.90%）。通过对上述数据进行χ2检验，由于云鹤镇和黄坪镇阳性人数为零，为了统计分析，将该两组数据去除以后进行χ2检验得出χ2=4.372，P=0.728＞0.05，可认为鹤庆县不同乡镇地贫阳性率差异无统计学意义。

3.5.3 β地贫携带者血常规筛查分析结果 （1）地贫基因携带者与正常人群的血常规比较见表1。

表1 地贫组与非地贫组血常规的t检验比较（xˉ± s）

由表1可知，经过血常规的两项指标MCV、MCH可以看出，地贫携带组和非地贫携带组这两项指标之间进行t检验，差异有统计学意义（P＜0.01），地贫组MCV与MCH均低于正常人群（MCV＜83 fl，MCH＜27 pg）。

（2）鹤庆地区不同β地贫基因突变类型的血常规比较见表2。

表2 不同β地贫基因型的血常规的t检验比较（xˉ± s）

由表2可以看出，β地贫基因突变类型为CD26杂合突变与CD56杂合突变的血常规经过t检验比较，得出P＜0.01，可见，CD26杂合突变与CD56杂合突变的MCV、MCH差异有统计学意义，CD26杂合突变基因型其MCV与MCH低于CD56杂合突变基因型，由此可见，CD56杂合突变无临床表型，其血常规表现为正常。

（3）不同地区β地贫携带者的血常规比较见表3。

由χ2分析可知，MCH在组间差异有统计学意义，进一步两两比较发现，除了龙开口镇与其他地区差异无统计学意义外，P龙开口镇与其他=0.056；其他乡镇与鹤庆县外的其他地区差异均有统计学意义，P辛屯镇与其他=0.032，P草海镇与其他=0.003，P松桂镇与其他=0.014，P西邑镇与其他=0.016，P金敦乡与其他=0.001，P六合乡与其他=0.003。由秩和检验结果，χ2（H）=8.053，V=7，P=0.328＞0.05，可见该地区不同乡镇其MCV的差异无统计学意义。

表3 不同地区β地贫携带者血常规比较

3.5.4 β地贫基因携带者基因诊断的分析结果 通过对醋酸纤维素薄膜电泳条带异常者进行基因诊断，未见α地贫基因携带者，β地贫基因诊断31例。

（1）基因突变类型的统计分析：对鹤庆地区调查的31例临床诊断或疑似地贫的受检者中，检出β珠蛋白基因突变31例，包括2种基因突变类型，其中29例为CD26（GAG→AAG）突变，2例为CD56（GGC→GAC）突变。

（2）2种β地贫基因型以及正常人的血常规的分析见表4。

表4 2种β地贫基因型以及正常人的血常规的分析比较

由χ2分析可知，MCV、MCH在组间不全相同，基因型为CD26的人群其MCV与MCH的值均低于正常人，但高于CD56型，进一步两两比较发现，CD26基因突变类型与正常人和CD56组间差异具有统计学意义（P＜0.000），进一步两两比较发现，CD56基因突变类型与其他两组组间差异无统计学意义。

（3）DNA测序结果分析：由于血红蛋白醋酸纤维素薄膜电泳异常条带的特殊性，将出现异常条带的31例样本全部进行β珠蛋白基因诊断中国人常见的17种β珠蛋白基因突变类型，结果29种为βE杂合突变类型（即CD26），2例基因检测表现为正常，对其进行DNA测序分析，结果该2例基因突变类型为CD56；最后得出该地区β地贫的携带率为2.38%。3.5.5 建立家族遗传图谱 通过对1 303个样本进行筛查诊断，有31例阳性受检者，在知情同意的条件下进一步对其直系三代亲属进行同样的筛查研究从而建立家族图谱，结果显示，其父母必有一方为携带者，其配偶未见异常，但部分家族其子女为携带者，部分为正常，其兄弟姐妹皆部分为携带者，在筛查诊断过程中，发现1例家族中先证者母亲为CD26纯合子突变。见图4。

图4 部分代表性家族遗传图谱

4 讨论

4.1 云南省鹤庆县地贫以β地贫为主地中海贫血广泛分布于地中海沿岸国家及其他曾经疟疾高发地区〔4〕，我国长江以南各省发病率高，多见于广东、广西、海南、云南、香港、福建、江西、贵州、四川、重庆、湖南等地区，高发区发病率在2%～3%〔5〕，此次调查研究结果提示云南省鹤庆地区主要为β地贫，未筛查出α地贫类型，β地贫的发生率为2.38%，属于地中海贫血高发区之一，文献报告提示区域不同，民族不同，发病率及检出率不同，β地贫主要集中在西部地区〔6〕，云南省属于少数民族聚居区，各民族众多，贫血的种类又以地贫为首发，其地贫分布显示了明显的民族性，有研究显示云南省以傣族地贫的发病率最高〔7-9〕，同属西部的云南省大理市鹤庆县，少数民族主要为白族，其次为彝族、傈僳族，但各民族间未见明显的统计学差异。

4.2 云南省鹤庆县β地贫基因突变类型及特点迄今，世界上已报道的β珠蛋白基因突变类型已有200多种，其中中国人群发现有50多种，随着科学技术的进步，β地贫基因新突变将会不断被发现和鉴定；在中国人群中，β珠蛋白基因最常见的有17种突变类型，其中以 CD41-42（-CTTT）、CD17（AAG→TAG）、IVS-Ⅱ-654（C→T）最常见。对鹤庆地区的研究结果显示云南省鹤庆县地区婚前婚配及孕产期群体其β珠蛋白基因突变谱与国内其他地区的报道明显不同〔10-11〕，31例β地贫中β珠蛋白基因突变检出最多的类型为CD26（GAG→AAG），另外2例为CD56（GGC→GAC），这与国内其他省市人群完全不同，相比较而言，福建、厦门、湖北等地区以 IVS-Ⅱ-654 最多见〔12-16〕，广东、广西、重庆等地以 CD41-42 最多见〔17-20〕，四川、贵州以CD17 最多见〔21-22〕，而昆明地区的报道以及邹团标等〔23〕的研究结果显示β地贫基因突变类型以CD17突变的发病率最高〔24〕，可见云南省大理州鹤庆县地区β地贫基因突变有着自身的特点，β地贫基因突变类型以CD26（GAG→AAG）为主。

通过鹤庆地区2种β地贫的基因突变类型人群的血常规指标分析发现，地贫携带者与非地贫携带者的血常规差异比较有统计学意义，地贫携带者其MCV和MCH均低于非地贫携带者。研究发现：CD26与CD56的MCV和MCH差异有统计学意义，CD26型其MCV与MCH低于CD56杂合突变基因型，CD56杂合突变无临床表型，其血常规表现为正常。由此可见，MCV和MCH在地贫的筛查诊断应用中有着重要的临床价值，MCV筛查地贫灵敏度较高，可作为筛查的首选方法〔25〕。但有研究表明，特异度较高的β地贫的血红蛋白电泳筛查标准为HbA2＞4.5%或出现HbE带〔26〕。因此通过参考血常规MCV与MCH两项指标结合HbA2的含量可为临床诊断地贫提供更准确的参考依据〔27〕。

4.3 建议

4.3.1 地方政府加强对该地区地贫干预服务提供支持 地中海贫血是由于人体珠蛋白基因突变或缺失而导致某种珠蛋白链合成障碍，造成α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡而导致的溶血性贫血，是世界上发病率高、危害性大的单基因遗传性疾病。婚育前保健一方面可以筛查出不适合生育的遗传性、生殖系统和传染性疾病，另一方面还可以对新婚夫妇进行婚前卫生指导，普及生育健康孩子的科学知识，使育龄期人群充分掌握相关生育知识、遗传病知识和生殖保健知识。通过婚前婚配人群地贫筛查不仅能够有效减少重度地贫患儿的出生，而且能够让育龄人群在婚前通过医学检查了解自己和配偶的身体状况，同时得到医务人员的健康教育指导，为健康婚姻和优生优育提供有力保障。

广东等省相关项目陆续开展并取得了良好的效果，而云南省防控项目2012年才由朱宝生教授主持开展，因起步较晚，经费不足，至今只建立了文山、德宏、西双版纳3个地贫筛查试点。近年来有关地中海贫血发病率的文献报道中，提示我国发病率较高地区还有相当多的地区未开展地中海贫血的流行病学研究。由于缺乏全国流行病学资料，影响国家与地方政府对地中海贫血防治的重视，未能从国家与地区层面制定相应的防控措施。

因此，有必要开展全国或高发地区血红蛋白病的流调工作，为国家或地区制定血红蛋白病的防治政策、建立防控网络组织提供科学依据，最终达到降低重型地贫患儿的出生率〔28〕。

4.3.2 加强对地中海贫血认识的宣传力度 通过鹤庆地区为期一个多月的调查研究发现，大多数人对地中海贫血的认识不足，很多人对该病的认识只停留在对贫血的了解，未能从根本上认识地中海贫血。说明相关部门缺乏对广大群众进行重型地贫患儿出生带来的危害的宣传认识，以及做好地贫携带患儿的相关保健服务治疗，提高整体出生人口质量以及人民群众幸福的宣传和认识，有必要进一步深入研究提高人民群众对该病的认识度以及重视度，并做好婚前婚配以及孕产期检查，预防同型地中海贫血夫妇婚配所导致的重型地贫患儿出生。

4.3.3 近年来国家二胎政策的实施，势必会加重地贫的患病风险 地中海贫血是一种单基因隐形遗传病，国家对二胎政策的实施，势必会加大地贫的发病风险，通过调查研究发现，地贫表现为明显的家族聚集性，由此带来的社会、经济、精神负担也将严重影响各地区城乡发展与各家庭的和谐相处，降低整体人口生活质量水平。因此，需要更加注重婚前婚配与孕产期的检查以及保健。

4.3.4 本次调查研究有待改善之处 由于本次调查的样本量相对较小，基因检测局限于血红蛋白电泳检测结果异常的样本，且所采用β地贫基因检测试剂盒主要检测我国常见的β珠蛋白基因17种突变类型，最终所得的地贫类型也都只是β地贫类型，虽然据其他研究报告，云南省主要为β地贫，但是在血红蛋白电泳筛查的过程中，由于静止型的α地贫血红蛋白电泳结果正常，对鹤庆地区的研究可能存在α地贫类型的漏查，就鹤庆地区地贫筛查，判断鹤庆地区各人群的地贫基因携带率、民族分布、区域分布等结果不够精确，需要进一步扩大样本量以及增加实验手段来加以证实。