冷却猪肉中降胆固醇假单胞菌的筛选与鉴定

王京，张明赞

（贵州工业职业技术学院，贵州贵阳550025）

假单胞菌（Pseudomonas.spp）是一种外形为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，也是一种严格好氧菌、从不发酵的无核细菌。导致冷却肉类腐败变质的主要微生物有多种，假单胞菌是其一[1－2]，占肉类腐败微生物的25%～26%。田璐等[3]研究表明，假单胞菌利用肌氨酸的能力比较强，促使了需氧型假单胞菌在有氧条件下大量繁殖，因而引起冷却肉腐坏[4]。假单胞菌需要足够的碳源与能源才能存活。冷却猪肉含有丰富的碳源和能源，是我国和国外日常生活主要的肉类食品之一[5]。冷却猪肉因其保质期长，柔软多汁，口感细腻、鲜美，是猪肉产业的发展趋势[6]。在低温贮藏条件下，导致肉类腐坏的微生物中，假单胞菌占很大比重[7]。因此，越来越多的研究更加关注的是假单胞菌作为腐败菌研究，而对假单胞菌的其他功能性研究还不够深入。

目前，随着人们的生活质量不断提高，膳食营养亦日益丰富，患高脂血症等心脑血管疾病的机率也增大了。最新流行病学调查报告[8]表明胆固醇水平每降低1%，冠心病的发病率就会降低2.5%，因此科研工作者们争相研究怎样才能降低人体血清的胆固醇含量。目前，人们通常用3种方式来调节人体内血清的胆固醇量，一是控制食品中胆固醇的摄入量，二是抑制胆固醇在体内的合成，三是促进体内胆固醇的转化及排泄。最近，科学家们发现胆固醇的代谢与假单胞菌有关，主要是假单胞菌能产生一种降胆固醇脂酶的作用[9－10]。目前我国主要是从国外引进假单胞菌，因此有必要筛选出具有自主知识产权的降胆固醇假单胞菌菌株，而从冷却猪肉中筛选出新菌株比较容易。本研究主要从冷却猪肉中筛选一株假单胞菌株，使用邻苯二甲醛法测量菌株在降胆固醇方面的能力，并对耐酸性进行评估，为以后开发降胆固醇假单胞菌的食品药品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

依据国标GB/T 9959.2－2008《鲜、冻片猪肉》中要求，样本都是从超市购买后，贮藏特定温度范围（0℃～4℃）内，在2 h之内带回实验室。

假单胞菌培养基[11]：c－f－c 选择剂 0.1 g，酵母粉 3 g，吐温80和NH4NO3、胆固醇、牛肉膏各1 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O和KH2PO4各0.25 g，FeSO40.001 g，培养基的pH值调节为7.0±0.2；蒸馏水1 000 mL。

改良PTYG培养基（胰蛋白胨酵母培养基）[12]：吐温80 1 mL，盐溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸盐酸盐 0.5 g，琼脂粉 15 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，将各成分用蒸馏水1 000 mL，煮沸去除氧气，高温灭菌（121℃）20 min。

改良PTYG液体培养基：吐温80 1 mL，盐溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸盐酸盐0.5 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，将各成分用蒸馏水1 000 mL，煮沸去除氧气，高温灭菌（121℃）20 min。

PTYG琼脂培养基（含有 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷）：在改良PTYG培养基中加入X－gal（40 mg/L）[13]，X－gal放于－20℃避光保存，高温会分解，用灭菌水稀释至20 mg/mL，每个改良的PTYG琼脂平板涂布40 μL，现配现用。

降胆固醇培养基：加入胆固醇胶束溶液，使改良PTYG液体培养基成为含有胆固醇浓度为0.1 mg/mL的降胆固醇培养基。含有0.1 mg/mL胆固醇胶束溶液的1 000 mL的液体培养基的配制：（1）分析天平精确称取胆固醇0.1 g；（2）依次加入蔗糖八乙酸酯0.1 g，胆盐 0.2 g，吐温 80 1 mL，搅拌均匀；（3）加入 5 mL 冰乙酸加热溶解，超声15 min；（4）迅速加入到配好的改良PTYG液体培养基中，同时搅拌均匀，使其成为均一稳定的胶体溶液，121℃灭菌20 min。

胆固醇标准液的配制（1 mg/mL）：精密称取0.05 g（精确至0.01 mg）胆固醇（色谱纯）标品，放入小烧杯中，再加入10 mL无水乙醇，待完全溶解后定容至50 mL，即得1 mg/mL的胆固醇母液，4℃保存。

邻苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）试剂的配制（0.5 mg/mL）：精密称取 0.05 g（精确至 0.01 mg）邻苯二甲醛，放入烧杯中，再加入20 mL的冰乙酸，待完全溶解后定容至100 mL，常温避光保存，注意现配现用。

1.2 仪器与设备

MLS－3750高压蒸汽灭菌锅：三洋（SANYO）有限公司；SPX－250BY－III生化培养箱：常州恒隆仪器有限公司；FA2004电子天平：上海方瑞仪器有限公司；SWCJ－1D超净工作台：北京永光明医疗仪器有限公司；902－ULTS超低温冰箱：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CX21SF1奥林巴斯生物显微镜：奥林巴斯中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离筛选与鉴定

分离筛选：称取5.0 g冷却猪肉，放入锥形瓶，再向其中加入50 mL无菌生理盐水，再加入4颗小玻璃珠，在温度为37℃、转速设置为180 r/min的条件下振荡培养30 min，吸取5 mL振荡后溶液加入富集培养基（250 mL三角瓶装液量为50 mL）中，同样条件下摇床富集培养24 h。取0.2 mL稀释适当梯度的富集悬浮液涂布于假单胞菌培养基上，静置5 min后，平板倒置放于培养箱培养24 h，温度设置为37℃。将形成单一菌落，划线纯化后划Z形线保藏于斜面培养基上，37℃条件下培养1 d或2 d直到斜面出现丰满的菌落后，放于4℃冰箱保藏，菌株编号为JXJ。

生理生化实验初步鉴定：筛选出耐酸耐胆盐受性好且胆固醇去除率高的菌株，利用糖发酵鉴定管和对碳源的利用[14－15]鉴定并观察记录结果，本试验中采用的糖发酵鉴定管中主要有13种糖（分别为D－核糖、无糖对照管、纤维二糖、棉籽糖、松三糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、D－阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖盐酸盐、淀粉）。

分子鉴定：利用传统的菌种鉴定方法如菌落特征、形态特征、生理生化特征[16]和16S rRNA、recA基因序列分析对菌种进行准确的分类鉴定，并构建系统进化树（用MEGA5.0生物学软件），采用邻近相连算法（Neighbor－joining）对该菌株的16S rRNA序列进行分析，初始值设定为1 000次，之后在树枝上对自展值进行标记，从而确定出菌株的种类[17]。

1.3.2 菌落形态特征及细胞形态特征观察

样品经处理后培养，由其形成菌落的形态和颜色筛选后用革兰氏染色法进行处理，然后用显微镜观察，先用低倍镜找到菌落，再换用高倍镜观察单个细菌形态特征，同时做好记录。挑菌，原则是挑选菌落较小、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色且质地柔软的单一菌落，将挑出的菌落在改良的PTYG的琼脂培养基上纯化，通常传代4次后，可以得到纯化菌株，编号记录，并用甘油冻存于-80℃。

1.3.3 绘制邻苯二甲醛法（OPA）标准曲线

设置6个清洁试管，分别吸取0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mL的胆固醇标准液置于其中，再分别加入无水乙醇，使试管中溶液体积为1 mL，数据见表1，在各试管中加入4 mL的OPA试剂，在室温条件下放置10 min。然后向其中缓慢加入4 mL的浓硫酸，为使其充分混匀，用振荡器振荡20 s，完成后放置于黑暗条件下10 min，最后测其在550 nm处的吸光值，以吸光值为x轴，胆固醇浓度为y轴绘制标准曲线，拟合出线性回归方程。用1 mL无水乙醇作为空白对照组。

表1 胆固醇标准曲线数据表Table 1 Data list of cholesterol standard curve

1.3.4 假单胞菌待测液的准备

将之前冻存的纯化菌株进行复苏，方法是将取出的菌株迅速放入37℃的水浴锅中，可适当晃动以使其快速融化，再用移液枪吸取100 μL滴在改良的PTYG液体培养基上，用玻璃棒涂布均匀，倒置放于CO2含量5%，湿度100%，温度37℃的培养箱中，培养2天后，再进行挑菌，然后用平板划线的方法进行纯化，传代3次后，接种在改良的PTYG液体培养基中，37℃摇床上进行摇菌，24 h后将菌液收集至离心管进行离心，计数，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution）重悬菌液，使菌体量为3×108CFU/mL，后将其按接种量为10%（体积分数）接种于含有0.1 mg/mL胆固醇的PTYG液体培养基，摇床摇菌24 h后离心管收集菌液，离心后取上清，同时用适量PBS洗涤菌落2次，每次洗涤液可转入上清，一同作为待测液用于测定胆固醇的去除率，并同时设置空白对照，即空白的未添加菌落的胆固醇培养基。假单胞菌降胆固醇率S按公式（1）计算：

式中：S为胆固醇去除率，%；A为未接种菌株的含有胆固醇的PTYG液体培养基中胆固醇的含量，mg/mL；B为待测上清液中胆固醇的含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸实验

将细菌悬液以接种量为5%（体积分数）分别接种于pH值7.0和3.0的改良PTYG液体培养基中（pH值用0.1 mol/LHCl或NaOH调节），摇匀后放入孵箱，静置2 h，每组重复3次。再用灭菌后的生理盐水按10倍的比例进行梯度稀释，至适合浓度后，吸取100 μL均匀涂布于改良的PTYG固体培养基上，倒置于放入CO2孵箱，24 h后，进行计数。

菌株的存活率N按公式（2）计算：

式中：N为菌株存活率，%；N0为菌株的存活菌数（在pH值为3.0的PTYG液体培养基中培养2 h后）；N1为菌株的存活菌数（在pH值为7.0的PTYG液体培养基中培养2 h后）。

1.3.6 数据处理与统计分析

本试验数据均由SPSS 20.0，OriginPro9.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌落与细胞形态

在平板上挑一株假单胞菌株，记：菌株JXJ。菌株的平板菌落形态如图1。

图1 纯化菌落形态和镜检10×40倍Fig.1 Schematic of puried colonies morphology and microscopy

由图1可知，菌落在假单胞菌培养基上的生长速度较快，菌落特征明显，呈淡黄色半透明，近圆形，边缘齐整，光滑稍隆起，菌落直径1.5 mm～3.0 mm，经比对该株菌株与荧光假单胞菌（P.fluorescens）特征接近。根据以上形态及生理生化特征可知菌株JXJ的特征符合假单胞杆菌属，初步鉴定它属假单胞菌属（Pseudomonas）。

2.2 假单胞菌降胆固醇能力

2.2.1 绘制OPA法测降胆固醇的标准曲线[16]

按照表1对不同浓度的胆固醇测定其在550 nm处的吸光值A550，标准曲线如图2所示。

图2 胆固醇标品的OPA标准曲线图Fig.2 Standard curve of cholesterol measured by OPA

图2表明了在0～0.20 mg/mL范围内，当胆固醇浓度增加的时候，吸光值也随着增加。根据图2得出了胆固醇标准曲线的线性回归方程y=4.926 4x-0.013 0，其相关系数R2=0.999 2。

2.2.2 菌株的胆固醇去除能力

将筛选到的JXJ株菌，纯化后挑选10株菌，分别标注JXJ1、JXJ2、JXJ3、JXJ4、JXJ5、JXJ6、JXJ7、JXJ8、JXJ9、JXJ10。对胆固醇的去除能力用邻苯二甲醛（OPA）法测定，得到菌株的降胆固醇能力见表2。

表2 不同菌株的体外胆固醇去除率的结果（M±SD，n=3）Table 2 Degradation rate of cholesterol of strains in vitro（M±SD，n=3）

由表2可知，10株假单胞菌胆固醇去除率均达到了5.00%以上，最高的是菌株JXJ7达到了7.01%，结果表明这10株菌都具备一定的降胆固醇能力，为进一步筛选出所需要的菌株，选择胆固醇去除率最高的JXJ5、JXJ7、JXJ8 3株进行下一步耐酸受性实验。目前，对菌株的胆固醇去除率研究主要体现在双歧杆菌，而对假单胞菌的降胆固醇研究还处于探索阶段[22]。

2.3 酸耐受性结果

随着培养时间的延长，假单胞菌的数量在减少[16]，目前，主要用活菌体内增殖的方法来提高体内假单胞菌的数量。因为人体胃液的pH值通常维持在0.9～1.8左右[17]，当人体食用带假单胞菌食品或者药品时，假单胞菌会在小肠中发挥益生作用。在进食的过程中，因为每个人的身体素质不同，吃的食物也有差异，所以胃部的pH值通常会在1.8～6.0范围内变化，但是一般在3.0左右。除此之外，人们所吃的食物一般会在胃中停留90 min，且肠道中不同部位的pH值会有所不同[17]。而假单胞菌生长的最适pH值在6.5～7.0之间，因此，本研究中对所筛选的菌株进行了酸耐受性的实验，不同菌株的耐酸受性也会有差异，3株降胆固醇能力高的菌株其耐酸性能见表3。

表3 菌株耐酸性能结果（M±SD，n=3）Table 3 Strains’tolerance to low pH（M±SD，n=3）

由表3可知，3株假单胞菌在酸性条件下的存活率均在90%以上，表明这3株菌都具备一定的耐酸能力，而且耐酸能力较好。其中JXJ7的存活率最高，达到了96.13%。可以看出，酸性条件会在一定程度上抑制假单胞菌的生长，但存活率仍然高于95%，主要是因为菌株具有较强的耐酸性。近年来，假单胞菌的耐酸性广受研究者的关注，研究结论表明与章茂林等[23]研究的假单胞菌的耐酸性一致。

2.4 菌株生理生化实验初步鉴定

自筛菌株JXJ7的[19-20]鉴定结果如表4和表5，可以看出所筛选的假单胞菌有很好的生理生化效果，结合菌株的菌落形态、菌株形态特征和糖发酵实验结果与GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》及伯杰氏细菌鉴定手册对照得到JXJ为动物假单胞菌。

表4 菌株JXJ的生理生化鉴定结果Table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

续表4 菌株JXJ的生理生化鉴定结果Continue table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

2.5 序列分析

将JXJ菌株的全部16S rRNA序列[21]分别提交到NCBI，通过Blast在线程序在GenBank数据库中检索与已刊登的16S rRNA序列同源性进行比较，下载同源性较高的菌株的序列，使用软件MEGA 5.0对其进行分析，通过邻近法对系统树进行构建，并且Bootstrap1000次检验分子系统树置信度获得系统发育树（见图3）。

表5 JXJ生理生化特征-碳源利用Table 5 Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the strain JXJ

图3 基于JXJ的部分16S rRNA序列同源性构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree on the similarity of partial 16S rRNA sequence of the strain JXJ

从系统发育树中可以看出，该菌所在的最大分支中其所包括的菌株均为假单胞菌，菌株JXJ的16S rRNA序列与Pseudomonas sp.HY13KR序列同源性在99%以上，且属于同一个最小分支中，因此菌株JXJ的鉴定结果为动物假单胞菌乳亚种。

3 结论

在冷却猪肉中所筛选的JXJ7为假单胞菌并具有很好的生理生化特性，其表面光滑，边缘整齐且为半透明或不透明状，经镜检多呈杆状，菌落微小，为革兰氏阴性菌株，假单胞菌的胆固醇去除率为7.01%，在pH3.0条件培养下，其存活率高达96.13%，具有很好的耐酸性。本研究为假单胞菌的预测和检测提供了有效工具，研究假单胞菌作为相关药品食品来降低体内的胆固醇提供了数据支撑，同时为开发降胆固醇假单胞菌的食品药品奠定基础。